第四章第一節(jié)染菌的防止

第四章

發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù)思考題1、染菌對(duì)發(fā)酵有什么危害，哪些原因會(huì)引起染菌？染菌以后應(yīng)采取什么措施？2、簡(jiǎn)述好氧發(fā)酵時(shí)無(wú)菌空氣制備的工藝流程與要求。什么是染菌？發(fā)酵過(guò)程中除了生產(chǎn)菌以外，還有其它菌生長(zhǎng)繁殖。一、發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌處理

滅菌（sterilization）是指用物理或化學(xué)方法殺滅或去除物料或設(shè)備中一切有生命物質(zhì)的過(guò)程。滅菌實(shí)質(zhì)上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細(xì)胞發(fā)生溶化、消失的現(xiàn)象。消毒（disinfection）是指用化學(xué)或物理的方法殺滅或去除病原微生物的過(guò)程，它一般只能殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞而不能殺滅細(xì)菌芽孢。消毒是一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的病原菌，而對(duì)被消毒的物體基本無(wú)害的措施。除菌（degerming）是用過(guò)濾方法除去空氣或液體中的微生物及其孢子。防腐（antisepsis）就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。如低溫、缺氧、干燥、高滲、添加防腐劑等。消毒與滅菌的區(qū)別消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用二、發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略（一）污染的危害（二）污染的防治

（一）污染（染菌）的危害1.染菌的不良后果

（1）使發(fā)酵培養(yǎng)基因雜菌的消耗而損失，造成生產(chǎn)能力下降直至倒罐，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失（2）由于雜菌的污染，對(duì)產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響，如產(chǎn)物收率降低或產(chǎn)品質(zhì)量下降。（3）雜菌的代謝改變?cè)磻?yīng)體系的PH，使發(fā)酵發(fā)生異常變化，（4）雜菌分解產(chǎn)物，使生產(chǎn)失敗。（5）細(xì)菌發(fā)生噬菌體感染，細(xì)菌細(xì)胞被裂解，導(dǎo)致整個(gè)發(fā)酵生產(chǎn)的失敗。2、染菌危害的具體分析

（1）染菌對(duì)不同菌種發(fā)酵的影響A．細(xì)菌谷氨酸：發(fā)酵周期短，培養(yǎng)基不太豐富，較少染雜菌，但噬菌體威脅大。肌苷：缺陷型生產(chǎn)菌，培養(yǎng)基豐富，易染菌，營(yíng)養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴(yán)重抑制菌生長(zhǎng)和合成代謝產(chǎn)物。B.霉菌PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破壞，發(fā)酵一無(wú)所獲。檸檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。C.酵母菌:易污染細(xì)菌以及野生酵母菌

D.疫苗：無(wú)論污染的是活菌、死菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。（1）染菌對(duì)不同菌種發(fā)酵的影響（2）染菌種類(lèi)對(duì)發(fā)酵的影響青霉素：怕染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌鏈霉素：怕染細(xì)短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌四環(huán)素：怕染雙球菌、芽孢桿菌和莢膜桿菌檸檬酸：怕染青霉菌肌苷（酸）：怕染芽孢桿菌谷氨酸：怕染噬菌體，易造成連續(xù)污染污染噬菌體噬菌體的感染力強(qiáng)，傳播蔓延迅速，也較防治，故危害極大。污染噬菌體后，可使發(fā)酵產(chǎn)量大幅度下降，嚴(yán)重的造成斷種，被迫停產(chǎn)。

污染其它雜菌有些雜菌會(huì)使生產(chǎn)菌自溶產(chǎn)生大量泡沫，即使添加消泡劑也無(wú)法控制逃液，影響發(fā)酵過(guò)程的通氣攪拌。有的雜菌會(huì)使發(fā)酵液發(fā)臭、發(fā)酸，致使pH下降，使不耐酸的產(chǎn)品破壞。芽孢桿菌耐熱，不易殺死。

由于接種量較小，生產(chǎn)菌生長(zhǎng)一開(kāi)始不占優(yōu)勢(shì)，而且培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，容易污染雜菌。種子染菌對(duì)發(fā)酵危害極大，應(yīng)嚴(yán)格控制種子染菌，如在此階段染菌，應(yīng)將培養(yǎng)液全部廢棄。（3）、不同發(fā)酵時(shí)期染菌對(duì)發(fā)酵的影響種子擴(kuò)大培養(yǎng)期染菌發(fā)酵前期染菌發(fā)酵前期最易染菌。原因：發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)；且還未合成產(chǎn)物（抗生素）或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。在這個(gè)時(shí)期要特別警惕以防止染菌的發(fā)生。措施：可以用降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整補(bǔ)料量，用酸堿調(diào)pH值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補(bǔ)救。如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補(bǔ)加一些營(yíng)養(yǎng)，重新接種再用。發(fā)酵中期染菌，處理困難，危害很大。處理方法應(yīng)根據(jù)各種發(fā)酵的特點(diǎn)和具體情況來(lái)決定。

發(fā)酵中期染菌

原因：發(fā)酵中期染菌會(huì)嚴(yán)重干擾產(chǎn)生菌的代謝。雜菌大量產(chǎn)酸，培養(yǎng)液pH下降；糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶，產(chǎn)物分泌減少或停止，有時(shí)甚至?xí)挂旬a(chǎn)生的產(chǎn)物分解。有時(shí)也會(huì)使發(fā)酵液發(fā)臭，產(chǎn)生大量泡沫。措施：降溫培養(yǎng)，減少補(bǔ)料，密切注意代謝變化情況。如果發(fā)酵單位到達(dá)一定水平可以提前放罐，或者抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。發(fā)酵后期染菌發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對(duì)雜菌有一定的抑制或殺滅能力。因此如果染菌不多，對(duì)生產(chǎn)影響不大。如果染菌嚴(yán)重，又破壞性較大，可以提前放罐。（4）、雜菌污染對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響1）發(fā)酵染菌對(duì)過(guò)濾的影響染菌的發(fā)酵液一般發(fā)粘，菌體大多數(shù)自溶，所以在發(fā)酵液過(guò)濾時(shí)不能或很難形成濾餅，導(dǎo)致過(guò)濾困難。污染雜菌的種類(lèi)對(duì)過(guò)濾的影響程度有差異如污染霉菌時(shí)，影響較小，而污染細(xì)菌時(shí)很難過(guò)濾。由于過(guò)濾困難，過(guò)濾時(shí)間拉長(zhǎng)，影響發(fā)酵液儲(chǔ)罐和過(guò)濾設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用，破壞了生產(chǎn)平衡。染菌發(fā)酵液還會(huì)因過(guò)濾困難而大幅度降低過(guò)濾收率，直接影響提取總收率。2）發(fā)酵染菌對(duì)提取的影響染菌發(fā)酵液中含有比正常發(fā)酵液更多的水溶性蛋白和其它雜質(zhì)。如果采用有機(jī)溶劑萃取的提煉工藝，則極易發(fā)生乳化，很難使水相和溶劑相分離，影響進(jìn)一步提純。如果采用直接用離子交換樹(shù)脂的提取工藝，如鏈霉素、慶大霉素，染菌后大量雜菌黏附在離子交換樹(shù)脂表面，或被離子交換樹(shù)脂吸附，大大降低離子交換樹(shù)脂的交換容量，而且有的雜菌很難用水沖洗干凈，洗脫時(shí)與產(chǎn)物一起進(jìn)入洗脫液，影響進(jìn)一步提純。如果絲狀菌發(fā)酵被產(chǎn)酸菌污染：則pH不斷下降，菌絲大量自溶，發(fā)酵液粘度增加，過(guò)濾困難。處理方法：①將發(fā)酵液加熱后再加助濾劑；②先加絮凝劑使蛋白質(zhì)凝聚后沉淀。雜菌分泌較多蛋白質(zhì)雜質(zhì)時(shí)，對(duì)發(fā)酵后處理過(guò)程中采用溶媒萃取的提取工藝非常不利，使水相和溶媒之間極易發(fā)生乳化（二）雜菌污染的防治

1.染菌的檢查與判斷染菌的檢查方法：顯微鏡檢查法鏡檢出雜菌需要一定時(shí)間平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法：菌落噬菌體檢查可采用雙層平板法：噬菌斑肉湯培養(yǎng)檢查法

發(fā)酵過(guò)程的異?，F(xiàn)象判斷：溶解氧、pH、尾氣中的CO2含量、發(fā)酵液黏度、顏色等的異常變化，都可能是發(fā)生染菌的重要信息。溶解氧水平的異常變化污染好氧性雜菌，溶解氧在短時(shí)間內(nèi)下降，并接近零值，長(zhǎng)時(shí)間不能回升；污染非好氧性雜菌，生產(chǎn)菌受到抑制，耗氧量減少，溶解氧升高。pH異常變化對(duì)于污染產(chǎn)酸菌或利用碳源效率高生長(zhǎng)較快的雜菌，會(huì)使pH迅速下降。12尾氣中CO2含量異常污染雜菌，糖耗加快，CO2含量增加；感染噬菌體，糖耗減慢，CO2含量減少。2、污染原因分析

主要原因：

①

種子帶菌②無(wú)菌空氣帶菌③設(shè)備滲漏④滅菌不徹底

⑤操作失誤⑥技術(shù)管理不善

染菌原因染菌百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌9.64接種時(shí)罐壓跌零0.19培養(yǎng)基滅菌不透0.79總空氣系統(tǒng)有菌19.96泡沫冒頂0.48夾套穿孔12.36盤(pán)管穿孔5.89接種管穿孔0.39閥門(mén)滲漏1.45攪拌軸密封滲漏2.09罐蓋漏1.54其它設(shè)備滲漏10.13操作原因10.15

原因不明24.94日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所多年來(lái)抗生素發(fā)酵染菌原因分析上海第三制藥廠染菌原因分析

染菌原因染菌百分率%種子帶菌14.15盤(pán)管穿孔14.20閥門(mén)滲漏23.30空氣系統(tǒng)有菌10.0管理不善25.80其它7.49原因不明5.78

管理不善而染菌，經(jīng)分析有下表所列原因：染菌原因染菌百分率%進(jìn)罐前未做設(shè)備嚴(yán)密度檢查25.8接種違反操作規(guī)程25.8檢修質(zhì)量缺乏驗(yàn)收制度19.35操作不熟練19.35配料違反工藝規(guī)程6.45調(diào)度不當(dāng)3.25（1）從污染雜菌的種類(lèi)進(jìn)行分析耐熱芽孢桿菌：滅菌不徹底；球菌或無(wú)芽孢桿菌：種子染菌、設(shè)備滲漏、無(wú)菌空氣帶菌、操作失誤；淺綠色雜菌：冷水管滲漏；霉菌：滅菌不徹底或操作問(wèn)題；酵母菌：糖液滅菌不徹底或放置時(shí)間較長(zhǎng)

發(fā)酵前期染菌種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌和設(shè)備滅菌不徹底、設(shè)備或管道有死角。發(fā)酵中后期染菌補(bǔ)料的料液滅菌不徹底或補(bǔ)料管道、閥門(mén)滲漏，操作不合理，一般不會(huì)是種子問(wèn)題。（2）從污染雜菌的時(shí)間進(jìn)行分析（3）從染菌的程度進(jìn)行分析數(shù)個(gè)發(fā)酵罐感染相同雜菌：空氣系統(tǒng)；個(gè)別罐連續(xù)感染雜菌：設(shè)備問(wèn)題；單罐染菌不是系統(tǒng)問(wèn)題，而是該罐本身的問(wèn)題。如種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、罐有滲漏、分過(guò)濾器失效。個(gè)別發(fā)酵罐連續(xù)染菌：設(shè)備問(wèn)題(如閥門(mén)的滲漏或罐體腐蝕磨損)，設(shè)備的腐蝕磨損所引起的染菌會(huì)出現(xiàn)每批發(fā)酵的染菌時(shí)間向前推移的現(xiàn)象。個(gè)別發(fā)酵罐偶然染菌：原因比較復(fù)雜，因?yàn)楦鞣N染菌途徑都可能引起。

多罐染菌系統(tǒng)問(wèn)題，如空氣過(guò)濾系統(tǒng)有問(wèn)題，特別是總過(guò)濾器長(zhǎng)期沒(méi)有檢查，可能受潮失效；移種或補(bǔ)料的分配站有滲漏或滅菌不徹底等。

如果發(fā)酵罐偶而染菌，原因一時(shí)找不出時(shí)一般可以采取以下措施：(1)連續(xù)滅菌系統(tǒng)前的料液貯罐在每年4一10月份(雜菌較旺盛生長(zhǎng)的時(shí)間)加入0.2%甲醛，加熱至80°C，存放處理4小時(shí)。(2)對(duì)染菌的罐，在培養(yǎng)液滅菌前先加甲醛進(jìn)行空消處理。甲醛用量每立方米罐的體積0.12－0.17升。(3)對(duì)染菌的種子罐可在罐內(nèi)放水進(jìn)行滅菌，滅菌后水量占罐體的三分之二以上。這是因?yàn)榧?xì)菌芽孢較耐干熱而不耐濕熱的緣故。3、雜菌污染的途徑及其預(yù)防（1）種子帶菌及其防治

種子帶菌的原因：滅菌不徹底(如假壓)；移種污染；培養(yǎng)或保藏過(guò)程中污染；無(wú)菌室管理不善；

防止種子帶菌措施：制備種子時(shí)對(duì)沙土管及搖瓶嚴(yán)格加以控制。沙土制備時(shí)要多次間歇滅菌注意接種時(shí)的無(wú)菌操作子瓶、母瓶的移種和培養(yǎng)無(wú)菌室和搖床間都要保持清潔。無(wú)菌室內(nèi)要供給恒溫恒濕的無(wú)菌空氣，還要裝紫外燈用以滅菌，或用化學(xué)藥品滅菌。無(wú)菌室結(jié)構(gòu)要求無(wú)菌室面積不宜過(guò)大，一般約4—6米2，高約2．6米。為了減少外界空氣的侵入，無(wú)菌室要有1—3個(gè)套間(緩沖過(guò)道)無(wú)菌室內(nèi)部的墻壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求無(wú)裂縫，墻角最好做成圓弧形。室內(nèi)布置應(yīng)盡量簡(jiǎn)單，最好能安裝空氣調(diào)節(jié)裝置，通入無(wú)菌空氣并調(diào)節(jié)室內(nèi)的溫濕度。無(wú)菌室的每個(gè)套間一般都用紫外線滅菌。無(wú)菌室接種要求打開(kāi)紫外燈，照半小時(shí)，關(guān)燈后15分鐘再接種。消毒藥水擦桌子、拖地，開(kāi)啟超凈臺(tái)的通風(fēng)，接種時(shí)必須在超凈臺(tái)上操作，保證無(wú)菌條件。接種人員必須穿好無(wú)菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干凈。（2）過(guò)濾空氣帶菌及其防治無(wú)菌空氣引起染菌的原因：流程或設(shè)備設(shè)計(jì)的合理性；過(guò)慮介質(zhì)選用、裝填；過(guò)慮介質(zhì)的滅菌和管理；空氣除菌系統(tǒng)復(fù)雜，環(huán)節(jié)多，偶遇不慎便會(huì)導(dǎo)致空氣除菌失敗?？諝饫鋮s器的列管穿孔泄露，冷卻水會(huì)滲入到空氣中，造成染菌。棉花-活性炭過(guò)濾器長(zhǎng)期使用后變薄的一邊失效。過(guò)濾介質(zhì)受潮失效：過(guò)濾器滅菌完畢應(yīng)立即緩慢通入壓縮空氣，將水分吹干。超細(xì)纖維紙作過(guò)濾介質(zhì)，滅菌時(shí)必須將管道中冷凝水放干凈，以免介質(zhì)受潮失效。

在生產(chǎn)實(shí)踐中，空氣管道大多與其它物料管道相接，要裝上止逆閥防止其它物料竄入空氣管道污染過(guò)濾器，導(dǎo)致過(guò)濾介質(zhì)失效。（3）設(shè)備的滲漏或“死角”造成的染菌及其防治

生產(chǎn)上常把不能徹底滅菌的部位稱(chēng)為“死角”

發(fā)酵罐的“死角”

法蘭、內(nèi)襯、接口、表頭、罐內(nèi)部件及其支撐件如攪拌軸拉桿、聯(lián)軸器、冷卻盤(pán)管、擋板、空氣分布管及其支撐件。口：人孔（或手孔）、排風(fēng)管接口、燈孔、視鏡口、進(jìn)料管口。/jpkc發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢罐底的加強(qiáng)板發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角”

消除方法：加強(qiáng)清洗并定期鏟除污垢；不銹鋼襯里破裂造成“死角”法蘭的“死角”a—墊圈內(nèi)徑過(guò)??；b—墊圈內(nèi)徑過(guò)大；c—法蘭不平造成的泄漏與“死角”abc滅菌時(shí)蒸汽不易通達(dá)的“死角”及其消除方法管道安裝不當(dāng)或配置不合理形成的“死角”安裝放汽邊閥

消滅死角的措施減少擋板和開(kāi)孔；焊接光滑；法蘭、閥門(mén)連接正好；減少殘?jiān)练e；嚴(yán)格清洗和檢查；定期檢修易壞部件化學(xué)腐蝕電化學(xué)腐蝕磨蝕設(shè)備加工不良防止設(shè)備滲漏：包括夾套穿孔、盤(pán)管穿孔、接種管穿孔、閥門(mén)滲漏、攪拌軸滲漏、罐蓋漏和其它設(shè)備漏等。防止設(shè)備滲漏肉眼可見(jiàn)——冷卻盤(pán)管、夾套穿孔、閥門(mén)滲漏……肉眼不可見(jiàn)——試漏水壓試漏法集氣桶試漏（4）培養(yǎng)基滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及其防治培養(yǎng)基滅菌不徹底原因：原料性狀：假壓——“冷壓”的形成；滅菌時(shí)培養(yǎng)基產(chǎn)生泡沫連續(xù)滅菌時(shí)參數(shù)不穩(wěn)定——時(shí)間維持不夠或壓力波動(dòng)較大；滅菌后期的罐壓驟變——“負(fù)壓”；設(shè)備死角。防治方法：原料性狀：大顆粒的原料過(guò)篩除去。實(shí)罐滅菌時(shí)要充分排除罐內(nèi)冷空氣。為什么蒸汽滅菌時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量泡沫呢？培養(yǎng)基和水的傳熱系數(shù)比空氣的傳熱系數(shù)大，如果滅菌時(shí)升溫太快，培養(yǎng)基急劇膨脹，發(fā)酵罐內(nèi)的空氣排出較慢，就會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，泡沫上升到發(fā)酵罐頂，泡沫中的耐熱菌就不能與蒸汽直接接觸，