蛋白質(zhì)與酶工程

第七章酶(蛋白質(zhì))的基因水平分子改造（蛋白質(zhì)工程）基因水平的蛋白質(zhì)分子改造是采用定點突變對蛋白質(zhì)編碼基因進行改造，改變蛋白質(zhì)的氨基酸獲得具有預期性狀的蛋白質(zhì)。突變酶新酶克隆酶分子設計第一節(jié)概述一、基因水平分子改造的基本程序第一，分離純化需改造的目標蛋白；第二，目標蛋白的序列分析、結(jié)構(gòu)分析和功能分析；第三，分子設計和結(jié)構(gòu)預測（計算機模擬）；第四，分離克隆目標蛋白的編碼基因；第五，基因定點突變；第六，突變基因的表達載體構(gòu)建與表達第七，突變蛋白的分離純化與功能檢測二、基因水平分子改造的基本內(nèi)容①改變酶促反應的Km與Vmax，可改變反應的催化效率；②改變蛋白的pH值或溫度穩(wěn)定范圍，可改變蛋白的作用條件；③改變蛋白在非水溶劑中的反應性，可使蛋白在非生理條件下作用；④改變某種酶，使其不再需要加入輔助因子，簡化持續(xù)生產(chǎn)過程；⑤提高酶對底物的親和力，以增強酶的專一性，減少不必要的副反應；⑥增強蛋白對胞內(nèi)蛋白酶的抗性，可簡化純化過程，提高產(chǎn)率；⑦改變酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)部位，減少反饋抑制，使產(chǎn)物的產(chǎn)率提高；⑧提高蛋白的抗氧化能力；⑨根據(jù)需要改變酶的底物專一性；⑩改變蛋白發(fā)生作用的種屬特異性。第二節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能分析一、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（ProteinDataBank，PDB）已收集了數(shù)萬個蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)。

對于PDB中沒有收錄或未見文獻報道的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)分析可通過以下方法獲得：

晶體學技術(shù)：ｘ射線晶體技術(shù)、中子衍射技術(shù)、電子晶體技術(shù)——蛋白質(zhì)晶體構(gòu)象

波譜學技術(shù)：多維核磁共振（NMR）、電子自旋共振——蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測：根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列構(gòu)建出蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)模型。二、蛋白質(zhì)功能分析生理功能的測定活性位點的測定作用條件的測定根據(jù)已知結(jié)構(gòu)信息化學修飾和突變方法根據(jù)蛋白質(zhì)同源性第三節(jié)酶（蛋白質(zhì)）的分子設計酶（蛋白質(zhì)）分子設計就是以酶（蛋白質(zhì)）結(jié)構(gòu)預測為基礎(chǔ)設計一個針對性地改造酶（蛋白質(zhì)）分子的方案。一、分子設計的類型基于天然蛋白質(zhì)的分子設計全新蛋白質(zhì)設計小改設計（1或幾個aa替換、刪除、插入）中改設計（一個肽段或一個結(jié)構(gòu)域）大改設計（從頭設計）二、分子設計的原理

1、內(nèi)核假設內(nèi)核是指蛋白質(zhì)在進化中保守的內(nèi)部區(qū)域。內(nèi)核由氫鍵連接的二級結(jié)構(gòu)單元（α螺旋或β折疊）組成，氫鍵都是最大化的。內(nèi)核都是致密堆積的疏水區(qū)(很少有空穴大到可以結(jié)合一個水分子或惰性氣體)，并且沒有重疊。

2、疏水或親水氨基酸需要合理地分布疏水性氨基酸通常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的活性中心區(qū)域；環(huán)區(qū)、轉(zhuǎn)角區(qū)和帶電荷區(qū)通常位于蛋白質(zhì)的表面，或在底物結(jié)合區(qū)和配基結(jié)合區(qū)。

3、注意保留脯氨酸、半胱氨酸殘基

脯氨酸是終止α螺旋區(qū)，兩半胱氨酸常形成起穩(wěn)定作用的二硫鍵。

4、注意保留活性中心區(qū)的保守氨基酸殘基

5、注意保留潛在的N糖基化位點（Asn-X-Ser／Thr-X-Pro）中的Asn、Ser或Thr。

6、在金屬蛋白中，配位殘基的替換要滿足金屬配位的幾何要求（鍵長、鍵角）三、分子設計的程序

1、以蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，利用計算機模擬技術(shù)確定突變位點及替換的氨基酸；

2、利用能量優(yōu)化及蛋白質(zhì)動力學方法預測改造后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；

3、預測的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能或功能-穩(wěn)定性相關(guān)知識及理論計算，預測新蛋白質(zhì)可能的性質(zhì)和功能。第四節(jié)基因定點突變寡核苷酸介導法

PCR突變法盒式突變法

DNAshuffling（結(jié)構(gòu)域互換、片段重組）一、寡核苷酸介導法

寡核苷酸介導法是指通過突變寡核苷酸引物在DNA合成中引起目的基因特定位點發(fā)生核苷酸插入、缺失或取代等突變。1、原理與程序測序驗證及突變基因片段回收表達載體構(gòu)建突變蛋白的表達分離純化及功能分析

2、突變寡核苷酸引物的設計原則

①必須與模板鏈上的目標DNA序列互補；

②必須足夠長以便特異地與目標DNA序列退火；單個核苷酸改變：17nt~19nt

兩個以上毗鄰核苷酸改變：＞25nt③突變核苷酸應位于引物中央；

④應避免可形成穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)；

⑤不能同模板的非突變區(qū)段形成穩(wěn)定的雜交體。

3、具體操作方法

①單引物法

突變引物②雙引物法突變引物、通用的測序引物以上兩種方法的突變率只有1%~5%

③Kunkel突變法雙引物、dU-模板，突變率達80%以上UUUUUUUUUUUUUUUUUU3’5’Pung-：尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷

dut-：dUTP酶缺陷轉(zhuǎn)染野生型株系模板鏈降解Kunkel方法宿主：E.coli

CJ236品系（dut-ung-）關(guān)鍵技術(shù)：制備高質(zhì)量的含U的單鏈DNA模板二、PCR突變法

利用PCR技術(shù)在體外進行定點突變，可使突變體大量擴增，提高突變效率。

1、產(chǎn)生取代突變的PCR突變法

2、產(chǎn)生插入突變的PCR突變法

3、產(chǎn)生缺失突變的PCR突變法三、盒式突變法（片段取代法）

利用DNA體外重組技術(shù)將一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片斷取代目標基因中的相應序列。四、DNAshuffling優(yōu)點缺點盒式突變法簡單，突變效率高靶DNA區(qū)段兩側(cè)需存在1對限制酶單一切點寡核苷酸介導法較簡單重組子篩選難PCR突變法突變效率100％擴增產(chǎn)物需連接到載體上；TaqDNA聚合酶拷貝的保真性第五節(jié)提高酶（蛋白質(zhì)）的應用性①提高酶的活性

②提高酶的穩(wěn)定性（耐熱、抗氧化）

③改變酶的底物專一性

④改變酶的最適pH

⑤改變酶對輔酶、輔基的要求

⑥改變酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)功能

⑦提高藥用蛋白的保存期⑧提高藥用蛋白的藥效一、提高T4溶菌酶的熱穩(wěn)定性（引入二硫鍵）具有二硫鍵的蛋白一般不易去折疊，熱穩(wěn)定性較高，且這種蛋白往往在有機溶劑或非正常生理條件（如極端pH值條件）下也不易變性。酶半胱氨酸的位置和數(shù)目二硫鍵數(shù)目相對活性%Tm/℃野生型酶Cys54、Cys97無10041.9突變酶ACys3、Cys9719646.7突變酶BCys9、Cys164110648.3突變酶CCys21、Cys1421052.9突變酶DCys3、Cys9、Cys97、Cys16429557.6突變酶ECys9、Cys21、Cys142、Cys1642058.9突變酶FCys3、Cys9、Cys21、Cys97、Cys142、Cys1643065.5二、提高酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性

在高溫條件下，Asn與Gln容易脫氨而變成Asp與Glu，這種改變有可能導致肽鏈的局部構(gòu)象發(fā)生改變，從而使蛋白失活。

酶氨基酸及其位置半壽期min野生型酶Asn14、Asn7813突變酶AAsn14、Thr7817突變酶BAsn14、Ile7816突變酶CThr14、Ile7825突變酶DAsp14、Asn7811三、提高重組β干擾素的專一活性和貯存穩(wěn)定性

重組β干擾素的抗病毒活性只有天然的10%，其原因是一些重組β干擾素形成了無活性的二聚體或寡聚體。

β干擾素有3個Cys，Cys31和Cys141形成分子內(nèi)二硫鍵，帶有游離巰基的Cys17形成分子間二硫鍵。

Cys17→Ser17，突變重組β干擾素的抗病毒活性提高到了100倍，與天然β干擾素相比其貯存穩(wěn)定性大大增強。四、提高α1抗胰蛋白酶的抗氧化性

α1抗胰蛋白酶對嗜中性白細胞彈性硬蛋白酶的抑制機理：α1抗胰蛋白酶與嗜中性白細胞彈性硬蛋白酶迅速結(jié)合，并切斷α1抗胰蛋白酶Met358和Ser359之間的肽鍵，形成更加穩(wěn)定復合體。氧化作用可使α1抗胰蛋白酶的Met358轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼醽嗧浚槐皇戎行园准毎麖椥杂驳鞍酌盖懈睿湟种谱饔脴O差。

Met358→Val358，α1抗胰蛋白酶的抗氧化能力增強。五、改變枯草桿菌蛋白酶的動力學活性酶第222位氨基酸KcatKm野生型蛋白酶Met501.4×10-4工程蛋白酶ACys844.8×10-4工程蛋白酶BSer276.3×10-4工程蛋白酶CAla407.3×10-4工程蛋白酶DLeu52.6×10-4

在lmol／L雙氧水環(huán)境中那些突變成不能氧化的氨基酸（如Ser、Ala或Leu）的酶仍保持活性，而野生型酶和替換成Cys的突變酶則很快就失活了。

六、改變枯草桿菌蛋白酶的最適pH

將枯草桿菌蛋白酶活性中心附近的一個Asp突變成Ser后，枯草桿菌蛋白酶的最適pH值下降了0.3個單位。七、提高水蛭素的凝血酶抑制活性

把47位的Asn變成Lys或是Arg時，它在試管中的抗凝血效率提高了4倍，是一種效果更強的抗凝血劑。在動物上檢驗其抗血栓形成的效果，發(fā)現(xiàn)其效率提高了20倍，甚至比肝素都高5倍。八、提高酪氨酰-tRNA合成酶的活性突變氨基酸KcatKmKcat/KmThr51

（野生）4.72.51.860Ala514.01.2