比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法

比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法蛋白質(zhì)的合成受時(shí)空等多種因素調(diào)控，在不同的組織細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成及表達(dá)的種類和數(shù)量有很大的差異，即使在細(xì)胞發(fā)育的不同階段，因不同時(shí)期、不同條件，蛋白質(zhì)組的構(gòu)成也在不斷的變化，是動(dòng)態(tài)的過程第一部分：基本概念比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第一部分：基本概念蛋白質(zhì)組(Proteome)指由一個(gè)基因組，或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。比較蛋白質(zhì)組學(xué)：蛋白質(zhì)組間差異蛋白的研究。比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第一部分：基本概念生物學(xué)問題的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的制備圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點(diǎn)的切取胰酶對(duì)脫色后蛋白質(zhì)消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測(cè)序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì)新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離比較蛋白質(zhì)組學(xué)基本技術(shù)路線Introduction蛋白質(zhì)的提取1蛋白質(zhì)的分離2蛋白質(zhì)樣品的分析3驗(yàn)證4第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法Introduction蛋白質(zhì)的提取1莢膜層細(xì)胞粘液層比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。樣品的分級(jí)處理可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡(jiǎn)單有效的處理是采用分級(jí)抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)行分離。樣品制備對(duì)于獲得可靠、準(zhǔn)確的2D電泳結(jié)果至關(guān)重要Introduction比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法增加樣品溶解性的手段變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團(tuán)。。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法—水浴加熱處理—TritonX-114相分離法提取膜蛋白—蛋白質(zhì)沉淀及透析除雜—真空冷凍干燥硫轉(zhuǎn)運(yùn)膜蛋白質(zhì)的有效分離和提取雙向電泳分離膜蛋白比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法雙向電泳具體步驟蛋白預(yù)處理（裂解，水化）蛋白質(zhì)上樣緩沖液的配制：一定量的

蛋白質(zhì)樣品溶解在緩沖液含7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，1%NP-40，2%IPG緩沖液，65mmol/LDTT，0.002%溴酚藍(lán)IPG條重泡漲及上樣第一向：IEFIPG條平衡平衡緩沖液Ⅰ(還原)平衡緩沖液Ⅱ(巰烷基化)第二向：SDS膠條染色及脫色凝膠成像及圖像分析比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法凝膠的圖像處理分析和差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的挖取及膠內(nèi)酶切凝膠圖像的掃描圖像加工斑點(diǎn)檢測(cè)和定量凝膠配比數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)呈遞和解釋2-DE數(shù)據(jù)庫的建立差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的挖取膠內(nèi)酶切ImageMaster2dPlatinum圖像分析軟件可用于膠的圖像分析比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法Introduction比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的挖取及脫色、膠內(nèi)酶切元素硫基質(zhì)中膜蛋白2-DE圖譜亞鐵基質(zhì)中膜蛋白2-DE圖譜選取差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)過脫色處理后用胰蛋白酶（Trypsin）進(jìn)行特異性酶切，最后進(jìn)行質(zhì)譜分析得到相關(guān)肽指紋圖譜比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法目前雙向電泳需解決的問題樣品的制備及溶解膜蛋白疏水性強(qiáng)初步分離高豐度蛋白、堿性蛋白及大分子量蛋白靈敏度及可重復(fù)性第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法N-端測(cè)序：得到的是序列。未知蛋白測(cè)序。稱為ProteinSequencing。

生物質(zhì)譜分析

：返回的數(shù)據(jù)是分子量?？梢院鸵阎牡鞍祝〝?shù)據(jù)庫）比對(duì)，告訴你是什么蛋白。稱為ProteinIdentificationbyMS。比較蛋白質(zhì)組學(xué)主流手段是生物質(zhì)譜分析

，價(jià)格便宜，分析速度快。比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法蛋白質(zhì)樣品的分析3比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法質(zhì)譜分析原理進(jìn)樣系統(tǒng)1.氣體擴(kuò)散2.直接進(jìn)樣3.色譜離子源1.電子轟擊2.化學(xué)電離3.場(chǎng)致電離4.激光

質(zhì)量分析器1.單聚焦2.雙聚焦3.飛行時(shí)間4.四極桿

檢測(cè)器MALDI-TOF一級(jí)質(zhì)譜儀，二級(jí)質(zhì)譜，MALDI-TOF-TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀，LC-MS/MS色譜質(zhì)譜連用比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法A.ferrooxidans胞外蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的肽指紋圖質(zhì)譜結(jié)果比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法軟件名稱MascotSEQUESTX!Tandem軟件類型商業(yè)軟件商業(yè)軟件免費(fèi)開源軟件數(shù)據(jù)格式MGF、DTA、PKLRAW、DTADTA、PKL、MGF、mzXML注：在線檢索均為免費(fèi)蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢索常用軟件常用的是Mascot比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法檢索的數(shù)據(jù)庫，可以知道數(shù)據(jù)庫大小匹配的結(jié)果大于70分即成功鑒定(可靠性達(dá)到顯著水平)縱坐標(biāo)：匹配的蛋白數(shù)目陰影線：區(qū)分匹配結(jié)果可靠與不可靠的分界線橫坐標(biāo)：匹配的蛋白得分小紅柱：匹配的結(jié)果比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法ProtParam蛋白質(zhì)序列的物理-化學(xué)參數(shù)（氨基酸、原子組成，等電點(diǎn)，消光系數(shù)等）MultiIdent通過等電點(diǎn)、分子量、氨基酸組成、序列標(biāo)簽、肽指紋數(shù)據(jù)等識(shí)別蛋白AACompSim蛋白質(zhì)氨基酸組成與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比分析AACompIdent通過氨基酸組成識(shí)別蛋白質(zhì)

3DProteinDisplayandSequenceAnalysisforthePC(UIUC)蛋白質(zhì)三維構(gòu)象展示第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法驗(yàn)證4比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法1.蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即WesternBlot?

試劑準(zhǔn)備?

樣品制備?

含量測(cè)定?

SDS－PAGE電泳?

轉(zhuǎn)膜?

免疫反應(yīng)?

化學(xué)發(fā)光?

凝膠圖象分析第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法未知樣品的Ct值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法2.熒光實(shí)時(shí)定量PCR（Real-timeqPCR）實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是通過對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。RT-PCR結(jié)果比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法XANES光譜：對(duì)提取