第七章預(yù)處理和固液分離技術(shù)

預(yù)處理及固-液分離技術(shù)第七章學(xué)習(xí)目標(biāo)知識(shí)要求掌握去除雜蛋白和金屬離子的方法和原理；掌握影響過(guò)濾速度的因素及改進(jìn)過(guò)濾性能的方法；掌握常用細(xì)胞破碎的方法，各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍。了解預(yù)處理的目的和方法，了解發(fā)酵液過(guò)濾特性。能力要求熟練掌握去除發(fā)酵液中雜蛋白和金屬離子的操作技能。學(xué)會(huì)包涵體的破碎技術(shù)。第一節(jié)發(fā)酵液過(guò)濾特性的改變，發(fā)酵液預(yù)處理和固-液分離下游技術(shù)生物分離過(guò)程的一般流程預(yù)處理和固液分離內(nèi)容固液分離發(fā)酵液胞外上清液/濾液預(yù)處理提取生化物質(zhì)的第一步，分兩部分：胞內(nèi)富集細(xì)胞第一節(jié)發(fā)酵液過(guò)濾特性的改變，發(fā)酵液預(yù)處理和固-液分離發(fā)酵液成分很復(fù)雜，包含菌（細(xì)胞）體，胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物，及剩余的培養(yǎng)基殘分等。目標(biāo)物質(zhì)濃度通常很低，雜質(zhì)較多，生物物質(zhì)一般又極不穩(wěn)定。一、發(fā)酵液過(guò)濾特性的改變發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為1-10%懸浮物顆粒小，細(xì)胞的相對(duì)密度與培養(yǎng)液相似可壓縮性液相粘度大，大多為非牛頓型流體性質(zhì)不穩(wěn)定，易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用影響懸浮狀態(tài)穩(wěn)定：雙電層、水化膜、布朗運(yùn)動(dòng)二、發(fā)酵液的預(yù)處理目的：①改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進(jìn)從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離效率；②分離菌體和其它懸浮顆粒，除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于提取和精制后繼各工序的順利進(jìn)行。二、發(fā)酵液的預(yù)處理（一）改變發(fā)酵液的過(guò)濾特性A-過(guò)濾面積，△p-操作壓力，μL-濾液粘度，Rm-介質(zhì)阻力，RC-濾餅阻力。二、發(fā)酵液的預(yù)處理（一）改變發(fā)酵液的過(guò)濾特性1.降低液體粘度

①加水稀釋法②升高溫度

加熱1）加熱降低液體粘度2）加熱使蛋白質(zhì)變性凝固變性蛋白質(zhì)的溶解度小。如檸檬酸發(fā)酵液加熱至80℃以上，可使蛋白質(zhì)變性凝固，過(guò)濾速度加快。只適用于對(duì)熱較穩(wěn)定的液體。注意加熱溫度與時(shí)間，不影響產(chǎn)物活性和細(xì)胞的完整性。加熱是發(fā)酵液預(yù)處理最簡(jiǎn)單最常用的方法。加熱能改善發(fā)酵液的操作特性。麥芽汁的黏度-溫度曲線。（一）改變發(fā)酵液的過(guò)濾特性2.調(diào)節(jié)pH

pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可改善其過(guò)濾特性。細(xì)胞(碎片)及某些膠體物質(zhì)在某個(gè)pH值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過(guò)濾的進(jìn)行。調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH到蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是除去蛋白質(zhì)的有效方法。大幅度改變pH還能使蛋白質(zhì)變性凝固。通過(guò)調(diào)整pH值改變膜過(guò)濾中易吸附分子的電荷性質(zhì)，可減少膜堵塞和污染；影響離子型絮凝劑的電離度。

0020040060061218pH4.6pH4.2pH3.8pH2.8FiltrateVolume,cm3Time,minutesFigTheeffectonfiltratevolumeofpH3.凝聚與絮凝

凝聚:是指在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，膠體粒子間因相互碰撞而產(chǎn)生凝集（1mm左右）的現(xiàn)象。絮凝:是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，當(dāng)一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)接時(shí)，形成粗大的絮凝團(tuán)（10mm）的過(guò)程，是一種以物理的集合為主的過(guò)程。（一）改變發(fā)酵液的過(guò)濾特性凝聚：膠體粒子在中性鹽促進(jìn)下脫穩(wěn)相互聚集成大粒子（1mm）

機(jī)理：

1）中和粒子表面電荷

2）消除雙電層結(jié)構(gòu)3）破壞水化膜

凝聚Coagulation因合并而沉降發(fā)酵液中菌體表面帶有負(fù)電荷，由于靜電引力使溶液中反離子被吸附在其周圍，在界面上形成了雙電層。正離子同時(shí)受到使它們均勻分布的熱運(yùn)動(dòng)影響，具有離開膠粒表面的趨勢(shì)。膠體雙電層結(jié)構(gòu)兩種相反作用力下，雙電層分裂成兩部：1）吸附層或stern層；2）擴(kuò)散層。形成了擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)模型(Gouy-Chapman-Sternmodel)。膠體雙電層結(jié)構(gòu)常用的凝聚劑電解質(zhì)有：硫酸鋁Al2(SO4)3?18H2O（明礬）；氯化鋁AlCl3?6H2O;三氯化鐵FeCl3;硫酸亞鐵FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+（一）改變發(fā)酵液的過(guò)濾特性絮凝：大分子聚電解質(zhì)將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成絮凝團(tuán)的過(guò)程

機(jī)理：架橋作用采用絮凝法可形成粗大的絮凝體，使發(fā)酵液較易分離。絮凝flocculation高分子絮凝劑的吸附架橋作用

聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點(diǎn)用量少，一般以mg/L計(jì)量；絮凝體粗大，分離效果好；絮凝速度快；種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點(diǎn)：存在一定的毒性，特別是陽(yáng)離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。目前最常見：聚丙烯酰胺類絮凝劑對(duì)于帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，采用陽(yáng)離子型高分子絮凝劑同時(shí)具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機(jī)理，單獨(dú)使用可達(dá)到較好絮凝效果；對(duì)于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機(jī)理才能提高過(guò)濾效果。這種包括凝聚和絮凝機(jī)理的過(guò)程，稱為混凝。

混凝絮凝的影響因素發(fā)酵液的性質(zhì)（細(xì)胞濃度，表面電荷）；絮凝劑的濃度，最佳用量為粒子表面積約有一半被聚合物覆蓋；絮凝劑的分子量；pH控制；攪拌速度。常用的凝聚劑電解質(zhì)有：硫酸鋁Al2(SO4)3?18H2O（明礬）；氯化鋁AlCl3?6H2O;三氯化鐵FeCl3;硫酸亞鐵FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3（一）改變發(fā)酵液的過(guò)濾特性4.加入助濾劑（filteraids）

一種不可壓縮的多孔微粒，在發(fā)酵液中加入固體助濾劑，則菌體可吸附于助濾劑微粒上，助濾劑就作為膠體粒子的載體，均勻地分布于濾餅層中，降低了濾餅的可壓縮性，減小了過(guò)濾阻力。常用的助濾劑是硅藻土，其次是珍珠巖粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纖維素、白土等。（一）改變發(fā)酵液的過(guò)濾特性5.加入反應(yīng)劑1）加入反應(yīng)劑與某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀,生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，又能使蛋白質(zhì)凝固，過(guò)濾性能上升，沉淀本身可作為助濾劑.如在新生霉素發(fā)酵液中加入CaCl2和Na3PO4，生成Ca3(PO4)2沉淀。發(fā)酵液中含有不溶性多糖物質(zhì)時(shí)，用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過(guò)濾速率。如萬(wàn)古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，發(fā)酵液過(guò)濾前加入0.025%的淀粉酶，攪拌30min后，再加2.5%硅藻土助濾劑，可提高過(guò)濾效率5倍。6.加入酶制劑（一）改變發(fā)酵液的過(guò)濾特性發(fā)酵液中的雜質(zhì)高價(jià)無(wú)機(jī)離子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）雜蛋白常規(guī)過(guò)濾或膜過(guò)濾時(shí)，易使過(guò)濾介質(zhì)堵塞，影響過(guò)濾效率。采用離子交換和吸附法提取時(shí)會(huì)降低其交換容量和吸附能力，有機(jī)溶劑法或雙水相萃取時(shí)，易產(chǎn)生乳化，使兩相分離不清。因此，在預(yù)處理時(shí)，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。（二）發(fā)酵液的相對(duì)純化

在采用離子交換提煉時(shí)，會(huì)影響樹脂對(duì)生化物質(zhì)的交換容量。高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除方法Ca2+——草酸、草酸鈉，→形成草酸鈣沉淀（注意回收草酸）

；Mg2+——三聚磷酸鈉，→形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物；Fe2+——黃血鹽，→普魯士蘭沉淀雜蛋白的去除方法沉淀法吸附法變性法雜蛋白去除-沉淀法

precipitationA等電點(diǎn)沉淀法（isoelectricprecipitation）蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大都在酸性范圍內(nèi)(pH4.0～5.5)，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH到蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是除去蛋白質(zhì)的有效方法。B.酸堿調(diào)節(jié)，使蛋白質(zhì)與離子形成沉淀在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子形成沉淀，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、苦味酸鹽等；在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽(yáng)離子形成沉淀，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等。雜蛋白去除-

吸附法adsorption加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。四環(huán)類抗生素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀K2Zn3[Fe(CN)5]2的膠狀沉淀來(lái)吸附蛋白質(zhì)，利用此法除蛋白質(zhì)已取得很好的效果。在枯草桿菌發(fā)酵液中，常加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，這兩者本身生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而加快了過(guò)濾速度。雜蛋白去除-變性

Denaturation

蛋白質(zhì)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則結(jié)構(gòu)的過(guò)程稱為變性。變性蛋白質(zhì)溶解度較小。加熱，大幅度調(diào)節(jié)pH值，加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑等。不足之處：加熱法只適合于對(duì)熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH值也會(huì)導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿；有機(jī)溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場(chǎng)合。

三、固-液分離（一）離心分離離心分離是利用轉(zhuǎn)鼓高速轉(zhuǎn)動(dòng)所產(chǎn)生的離心力，使懸浮液、乳濁液分離或濃縮的分離的過(guò)程。它具有分離速率快、分離效率高、液相澄清度好等優(yōu)點(diǎn)。但離心設(shè)備投資大、能耗高，連續(xù)排料時(shí)，固相干度不如過(guò)濾設(shè)備。（二）過(guò)濾過(guò)濾是指借助于一種能將固體物截留而讓流體通過(guò)的多孔介質(zhì)，將固體物與液體分離的單元操作。過(guò)濾技術(shù)可除去發(fā)酵液中的固體雜質(zhì)（如細(xì)菌菌絲）達(dá)到固液分離，為進(jìn)一步分離純化操作提供較澄清的溶液。（三）固液分離的其它方法雙水相萃取、吸附法、膜處理、絮凝等均可達(dá)到固液分離的目的。以上方法各有特點(diǎn)，通常是幾種方法綜合使用，以提高發(fā)酵液預(yù)處理效率。

生物分離過(guò)程的一般流程第二節(jié)細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎技術(shù)是利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目標(biāo)產(chǎn)物釋放出來(lái)。微生物革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌酵母菌真菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白質(zhì)(6-8%)脂類(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂類蛋白質(zhì)細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)一、細(xì)胞破碎方法分類機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：表面活性劑：酸堿酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理(一)機(jī)械法機(jī)械破碎法又可分為1.組織勻漿器2.研磨3.高速組織搗碎機(jī)4.高壓勻漿器5.高速珠磨機(jī)6.超聲波震蕩法

1.組織勻漿器

組織勻漿器由一內(nèi)壁磨砂的玻璃管和一根一端為球狀（表面磨砂）的桿組成。勻漿器的內(nèi)桿球體與管壁之間只有十分之毫米，組織破碎程度高，機(jī)械切力對(duì)生物大分子破壞較少。制造勻漿器的材料除玻璃外，也可用不銹鋼、硬質(zhì)塑料等。大多數(shù)情況下，用這種方法可切碎較薄的動(dòng)物組織膜，但不易打碎植物和細(xì)菌的細(xì)胞。2.研磨用研缽和研杵進(jìn)行，對(duì)細(xì)菌及植物材料應(yīng)用較多，它適用于細(xì)胞器的制備，如線粒體、溶酶體、微粒體等。一些難以破碎的細(xì)胞或微生物菌體則可加一些研磨劑，如玻璃粉、石英砂、氧化鋁、硅藻土等，破壁效果更好。3.高速組織搗碎機(jī)

搗碎機(jī)由調(diào)速器、支架、馬達(dá)、旋轉(zhuǎn)刀葉、有機(jī)玻璃筒等部分組成。操作時(shí)，先將材料配成稀糊狀液，置于筒體中約占1/3體積，蓋上蓋子。開動(dòng)馬達(dá)后，逐步加速至所需速度，轉(zhuǎn)速最高可達(dá)10000r/min。操作時(shí)溫度會(huì)迅速升高，需在圓筒周圍放冰冷卻。高速組織搗碎機(jī)適宜于動(dòng)物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)組織、柔嫩的葉和芽等材料的破碎。

4.高壓勻漿器高壓勻漿器由高壓泵和勻漿閥組成。細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動(dòng)過(guò)程中經(jīng)歷了高速剪切、碰撞及壓力驟降，造成細(xì)胞破碎。升高壓力有利于破碎減少細(xì)胞的循環(huán)次數(shù)，甚至一次通過(guò)勻漿閥就可達(dá)到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細(xì)胞碎片不至過(guò)小。但p大到一定值時(shí)對(duì)勻漿器的磨損增加，也有實(shí)驗(yàn)表明p超生一定值時(shí)，R增加但很慢。在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為55－70Mpa。破碎性能還隨菌體種類和生長(zhǎng)環(huán)境的不同而不同大腸桿菌的細(xì)胞比酵母細(xì)胞容易破碎，生長(zhǎng)在簡(jiǎn)單的合成培養(yǎng)基上的大腸桿菌比生長(zhǎng)在復(fù)雜培養(yǎng)基上容易破碎。影響高壓勻漿器細(xì)胞破碎因素高壓勻漿法適用的范圍大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法☆高壓勻漿法適用的范圍：酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎；料液細(xì)胞濃度可以很高，20%左右?！畈灰耸褂酶邏簞驖{法。易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽(yáng)性菌，含有包涵體的基因工程菌（因包含體堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥）5.高速珠磨機(jī)

珠磨是常用的方法細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機(jī)高速珠磨機(jī)工作原理磨室內(nèi)放置玻璃小珠，裝在同心軸上的園盤攪拌器高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞懸浮液和玻離小珠相互攪動(dòng)；細(xì)胞破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料滾動(dòng)引起在出口處，旋轉(zhuǎn)園盤和出口平板之間的狹縫很小，可阻擋玻離小珠，使不被料液帶出。由于操作過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生熱量，故磨室還裝有冷卻夾套，以冷卻細(xì)胞懸浮液和玻離小珠。6.超聲波震蕩法

超聲波震蕩法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。超聲波破碎的機(jī)理JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)一般認(rèn)為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation),液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性旋渦在細(xì)胞上造成了剪切力，使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，從而使細(xì)胞破碎。操作過(guò)程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部冷卻的容器中進(jìn)行。間歇操作。超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對(duì)酵母菌的效果較差。但超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。超聲波破碎的有效能量利用率極低由于對(duì)冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，但在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用。（二）非機(jī)械破碎方法1.物理法反復(fù)凍融冷熱交替滲透壓沖擊干燥法2.化學(xué)法溶胞3.酶解自溶法外加酶法其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣。反復(fù)凍融法

將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15℃），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過(guò)程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。冷熱交替法將細(xì)胞投入到沸水中，90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，可破碎絕大部分細(xì)胞。從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可使用這種方法。滲透壓沖擊法

滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過(guò)程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、真菌、植物細(xì)胞不適用。使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對(duì)干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來(lái)。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30℃的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌。冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)缺點(diǎn)是條件變化較劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其它組織變性。干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)?；瘜W(xué)法該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。有機(jī)溶劑能分解細(xì)胞壁中的磷脂，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來(lái)。有機(jī)溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等細(xì)胞破碎常用的表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）；。非離子型如TritonX-100和吐溫（Tween）等對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。表面活性劑無(wú)論表面活性劑是陰離子、陽(yáng)離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，能與細(xì)胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解EDTA螯合劑處理G-細(xì)菌，對(duì)細(xì)胞壁外層有破壞作用。G-細(xì)菌的壁外層結(jié)構(gòu)通常靠二價(jià)陽(yáng)離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來(lái)維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。酸、堿處理法酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。堿能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來(lái)成本低，反應(yīng)激烈，不具選擇性。

酶解法酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜。分為：自溶法、外加酶法優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)，能選擇性地釋放產(chǎn)物發(fā)生酶解的條件溫和收率高，細(xì)胞外形較完整缺點(diǎn)：溶酶價(jià)格高，溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶)產(chǎn)物抑制的存在。

只適用于小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室研究

酶解-自溶法

自溶作用是利用生物體自身產(chǎn)生的酶來(lái)溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代謝過(guò)程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長(zhǎng)過(guò)程繼續(xù)下去。自溶作用：改變其生長(zhǎng)環(huán)境（溫度、ｐＨ、緩沖液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過(guò)剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。缺點(diǎn)是：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速度下降。自溶法不適用于制備具有活性的核酸或活性蛋白質(zhì)。

外加酶法溶菌酶（lysozyme)能專一性地分解細(xì)胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷鍵，因此主要用于細(xì)菌類細(xì)胞壁的裂解。革蘭氏陽(yáng)性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。但對(duì)于革蘭氏陰性菌，單獨(dú)采用溶菌酶無(wú)效果，必須與螯合劑EDTA一起使用。放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽(yáng)性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶，酵母和真菌由于細(xì)胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。（三）包涵體的破碎包涵體是指異源的重組蛋白在宿主細(xì)胞（如原核細(xì)胞、酵母或真核系統(tǒng)）中高水平表達(dá)，生成的無(wú)定形的蛋白質(zhì)聚集體。不具生物活性，但一級(jí)結(jié)構(gòu)正確。與可溶形式的蛋白質(zhì)產(chǎn)物相比，包涵體蛋白具有一定的優(yōu)勢(shì)，包括產(chǎn)物濃度高（占細(xì)胞總蛋白質(zhì)的50%），不易被宿主的蛋白酶降解，對(duì)宿主細(xì)胞的毒性較低等。

機(jī)械破碎(高壓勻漿、高速珠磨）離心提取包涵體加變性劑溶解除變性劑復(fù)性包涵體制備重組蛋白的工藝路線

目標(biāo)蛋白的變性溶解

包涵體中不溶性的目標(biāo)蛋白必須溶解到液相中，才能進(jìn)一步純化。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質(zhì)變性才能使其形成可溶性的形式。

常用變性劑：▲

5-8mol/L鹽酸胍和6-8mol/L尿素,作用：破壞離子間相互作用；▲

表面活性劑如1-2％SDS，作用：破壞蛋白質(zhì)肽鏈間的疏水相互作用?！?/p>

PH>9.0的堿溶液和有機(jī)溶劑，使用較少。影響變性因素：時(shí)間、pH、離子強(qiáng)度、變性劑種類和濃度。二非機(jī)械法二原理：在變性劑溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵沒有破壞。當(dāng)部分變性劑被除去后，蛋白質(zhì)會(huì)重新折疊成具有活性的正確構(gòu)型，該過(guò)程稱復(fù)性。復(fù)性方法：稀釋法除變性劑－加入大量水或緩沖液。膜分離法除變性劑－透析、超濾、電滲析。層析法：凝膠層析，高效疏水層析

目標(biāo)蛋白的復(fù)性

蛋白質(zhì)復(fù)性影響因素：變性劑濃度目標(biāo)蛋白濃度；pH和離子強(qiáng)度；氧化還原條件。

還原劑：二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、還原型谷胱甘肽；氧化劑：

氧化型谷胱甘肽;堿性下通空氣。復(fù)性區(qū)

多聚物生成區(qū)

絮凝沉淀區(qū)鹽酸胍濃度mol/L紅血球碳酐酶復(fù)性操作中變性劑與蛋白質(zhì)濃度對(duì)復(fù)性的影響蛋白質(zhì)濃度mol/L細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。

直接測(cè)定法化合物產(chǎn)量測(cè)定法導(dǎo)電率測(cè)定法采用染色法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開來(lái)。如破碎的革蘭氏陽(yáng)性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細(xì)胞呈紫色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心，測(cè)定上清液中目的產(chǎn)物含量或活性，并與100%破碎率的標(biāo)準(zhǔn)值比較，計(jì)算其破碎率。（一）細(xì)胞破碎率的測(cè)定二、破碎效果的評(píng)價(jià)分類作用機(jī)理適用范圍機(jī)械法組織勻漿器固體剪切作用用于破碎較薄的動(dòng)物組織膜，但不易打碎植物和細(xì)菌的細(xì)胞。研缽固體剪切作用細(xì)菌及植物材料應(yīng)用較多，適用于細(xì)胞器的制備。高速組織搗碎機(jī)固體剪切作用操作時(shí)溫度會(huì)迅速升高，適宜于動(dòng)物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)組織、柔嫩的葉和芽等材料的破碎。高壓勻漿器液體剪切作用大規(guī)模破碎細(xì)胞常用設(shè)備，可達(dá)較高破碎率，對(duì)多種微生物細(xì)胞均適用，不適合絲狀菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。高速珠磨機(jī)固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難。超聲波振蕩法液體剪切作用最適合實(shí)驗(yàn)室規(guī)模細(xì)胞破碎。對(duì)酵母菌效果差，破碎過(guò)程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作。分類作用機(jī)理適用范圍非機(jī)械法反復(fù)凍融法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，適用于細(xì)胞壁較脆弱的新鮮細(xì)胞。不適合對(duì)冷凍敏感的目的產(chǎn)物，蛋白釋放量不足。冷熱交替法溫度劇烈變化適用于從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸。滲透壓沖擊法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其它方法結(jié)合使用。主要適用于不具有細(xì)胞壁、細(xì)胞壁較脆弱、細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或細(xì)胞壁合成受到抑制的細(xì)胞的破碎。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、真菌、植物細(xì)胞不適用。干燥法改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起蛋白質(zhì)或其它組織變性?？諝飧稍镞m用于酵母菌，真空干燥適用于細(xì)菌，而冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)?；瘜W(xué)法改變細(xì)胞膜滲透性有一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差。酶溶法酶分解作用專一性強(qiáng)，酶解條件溫和，漿液易分離，收率高，產(chǎn)品破壞少，不殘留細(xì)胞碎片。費(fèi)用較高，通用性差。常用于實(shí)驗(yàn)室研究。（三）細(xì)胞破碎方法的選擇

細(xì)胞破碎的一般原則：提取的物質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，采用機(jī)械方法；在細(xì)胞膜附近采用非機(jī)械法；提取產(chǎn)物若與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合時(shí)，采用機(jī)械法和化學(xué)法相結(jié)合的方法。適宜的細(xì)胞破碎條件應(yīng)該從高的產(chǎn)物釋放率、低的能耗和便于后步分離、提取這三方面進(jìn)行權(quán)衡。第三節(jié)沉淀分離純化技術(shù)沉淀法是指改變條件或加入某些沉淀劑，降低溶液中溶質(zhì)的溶解度，使溶質(zhì)由液相變成無(wú)定形固相析出的過(guò)程。第三節(jié)沉淀分離純化技術(shù)防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障⑴蛋白質(zhì)周圍的水化層（hydrationshell)，保護(hù)了蛋白質(zhì)粒子，避免了相互碰撞，使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。⑵蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，分子間靜電排斥作用。（存在雙電層）蛋白質(zhì)粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反離子的電荷構(gòu)成雙電層。一、鹽析沉淀法概述：“鹽析”意指在固體物質(zhì)的水溶液中加入高濃度中性鹽，固體物質(zhì)因溶解度減小而析出的過(guò)程。1-100nm鹽析法機(jī)理（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質(zhì)分子因熱運(yùn)動(dòng)碰撞聚集。（2）破壞水化膜，暴露出憎水區(qū)域，由于憎水區(qū)域間作用使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，憎水區(qū)域越多，越易沉淀。（3）中和電荷，減少靜電斥力，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，靜電斥力降低，導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。鹽析法機(jī)理一、鹽析沉淀法蛋白質(zhì)在水中的溶解度不僅與中性鹽離子的濃度有關(guān)，還與離子所帶電荷數(shù)有關(guān)，常用離子強(qiáng)度來(lái)表示對(duì)鹽析的影響。離子強(qiáng)度由下式計(jì)算：ci為溶液中i離子的濃度；Zi為i離子的化合價(jià)數(shù)蛋白質(zhì)在水中的溶解度與溶液的離子強(qiáng)度的關(guān)系可用Cohn鹽析方程表示：S為蛋白質(zhì)的溶解度；β、KS為鹽析常數(shù)；I為離子強(qiáng)度。

β—常數(shù)，圖中截距Ks—鹽析常數(shù)，圖中直線斜率Cohn經(jīng)驗(yàn)蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關(guān)系

β和Ks的物理意義β—β代表截距，即當(dāng)離子強(qiáng)度為零，也就是純水中的假想溶解度的對(duì)數(shù)。與蛋白質(zhì)種類、溫度、pH值有關(guān)，與鹽無(wú)關(guān)；Ks—鹽析常數(shù)，代表圖中直線的斜率；從一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ks與溫度和pH無(wú)關(guān)，但和蛋白質(zhì)與鹽的種類有關(guān)。但這種變化不是很大，例如以硫酸銨作為沉淀劑時(shí)，Ks值對(duì)不同的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，其變化不會(huì)超過(guò)1倍。用鹽析法分離蛋白質(zhì)的二種方法鹽析法分為兩類，第一類叫Ks分段鹽析法，在一定pH和溫度下通過(guò)改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，（固定pH,溫度，改變鹽濃度），由于蛋白質(zhì)對(duì)離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，用于早期的粗提液；第二種叫β分段鹽析法，在一定離子強(qiáng)度下通過(guò)改變pH和溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)，（固定離子強(qiáng)度，改變pH及溫度），由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶。鹽析作用要強(qiáng)鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來(lái)源豐富、經(jīng)濟(jì)1.無(wú)機(jī)鹽的種類（二）影響鹽析的因素1.無(wú)機(jī)鹽的種類在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價(jià)離子的鹽析作用較強(qiáng)，半徑大的低價(jià)離子作用較弱陰離子鹽析效果：檸檬酸＞PO43-＞SO42-

＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-陽(yáng)離子鹽析效果：NH4+＞K+＞Na+

＞高價(jià)陽(yáng)離子陰離子的影響大于陽(yáng)離子（二）影響鹽析的因素鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑（1）價(jià)廉；（2）溶解度大，溫度系數(shù)小，許多蛋白質(zhì)可以鹽析出來(lái)；（3）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，（4）不易引起蛋白質(zhì)變性。

1.無(wú)機(jī)鹽的種類缺點(diǎn)：（1）水解變酸；（2）高pH釋氨，腐蝕；（3）殘留產(chǎn)品有影響。（二）影響鹽析的因素鹽析操作(加鹽方式）硫酸銨的加入有以下幾種方法：1）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應(yīng)分批加入，并充分?jǐn)嚢?，使其完全溶解和防止局部濃度過(guò)高；2）加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來(lái)溶液體積不大的情況；它可防止局部過(guò)濃，但加量較多時(shí)，料液會(huì)被稀釋。3）透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結(jié)晶。鹽析用鹽量的確定-飽和度：飽和度（Saturation）的概念：以硫酸銨為例：250C時(shí)，硫酸銨的飽和溶解度是767g/L定義為100%飽和度.目標(biāo)蛋白質(zhì)的鹽析沉淀操作之前，所需的硫酸銨濃度或飽和濃度可通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。對(duì)多數(shù)蛋白質(zhì)，當(dāng)達(dá)到85%飽和度時(shí)，溶解度都小于0.lmg／L，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作范圍在40%-60%之間。鹽析的影響因素：無(wú)機(jī)鹽加入量

鹽析的影響因素：無(wú)機(jī)鹽加入量

分段鹽析鹽析的影響因素：蛋白質(zhì)濃度

沉淀蛋白質(zhì)鹽的濃度范圍并不是固定的，而是和起始濃度有關(guān)。高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，若蛋白濃度過(guò)高，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重共沉淀作用，除雜蛋白的效果會(huì)明顯下降。在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉淀作用比較少，但回收率會(huì)降低。因此需要在兩者之間進(jìn)行適當(dāng)選擇。分步分離提純時(shí)，寧可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液，多加一點(diǎn)中性鹽，使共沉淀作用減至最低限度。一般認(rèn)為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中。相當(dāng)于25mg/mL～30mg/mL。對(duì)起始濃度為30g/L的COMb溶液，大部分蛋白質(zhì)在硫酸銨飽和度為58-65％之間沉淀出來(lái)；但對(duì)稀釋10倍的COMb溶液，飽和度達(dá)到66%時(shí)才開始沉淀，而相應(yīng)的沉淀范圍為66-73%飽和度。鹽析的影響因素：pH值一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最小。為提高鹽析效率，多將溶液pH值調(diào)到目的蛋白的等電點(diǎn)處。注意在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與高鹽濃度下所測(cè)的結(jié)果是不同的，需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整溶液pH值，以達(dá)到最好的鹽析效果。

兩種蛋白質(zhì)的相對(duì)溶解度會(huì)隨pH而變化很大；β隨pH變化（1）對(duì)數(shù)關(guān)系（2）等電點(diǎn)附近有極小值lgS鹽析的影響因素：pH值在進(jìn)行鹽折時(shí)，必須控制pH圖中直線都相互平行Ksβ鹽析的影響因素：pH值鹽析影響因素：溫度的影響在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加。但在高濃度下，蛋白質(zhì)、酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，蛋白質(zhì)對(duì)鹽析溫度無(wú)特殊要求，可在室溫下進(jìn)行，只有某些對(duì)溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進(jìn)行。β隨溫度升高減小，熱促失水膜Ks不隨溫度而變蛋白質(zhì)的分級(jí)鹽析胎盤浸液50%硫酸銨飽和度，過(guò)濾沉淀，用于制備球蛋白上清液鹽酸調(diào)pH至4.2，過(guò)濾棄去上清液酸沉淀溶解后透析透析液70%硫酸銨飽和度，過(guò)濾棄去上清液沉淀，白蛋白粗品圖7-7人胎盤血白蛋白的制備工藝鹽析注意事項(xiàng)1.鹽析的成敗決定于溶液的pH值與離子強(qiáng)度，溶液pH值越接近蛋白的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)越容易沉淀。2.鹽析用硫酸銨，易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平鋪放入烤箱內(nèi)60℃烘干后再稱量，這樣更準(zhǔn)確。3.加入鹽時(shí)應(yīng)緩慢均勻，緩慢攪拌，越到后來(lái)速度應(yīng)該更注意緩慢，如果出現(xiàn)未溶解的鹽，應(yīng)等其完全溶解后再加鹽，以免引起局部的鹽濃度過(guò)高，導(dǎo)致酶失活。4.鹽析后最好攪拌40min～1h再在冰浴中放置一段時(shí)間。5.為避免鹽對(duì)酶的影響，一般經(jīng)脫鹽處理后再測(cè)酶活性。6.鹽析后的蛋白質(zhì)最好盡快脫鹽處理，以免變性，可用超濾處理。7.一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸銨濃度在70%左右。鹽析法特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：①適用范圍廣，幾乎所有蛋白質(zhì)和酶都能采用；②無(wú)機(jī)鹽不易引起蛋白質(zhì)變性失活；③操作簡(jiǎn)單，安全；④成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備⑤鹽析過(guò)程中非蛋白的雜質(zhì)很少被夾帶沉淀。缺點(diǎn)：沉淀物中含大量鹽析劑，而且硫酸銨易分解產(chǎn)生惡臭味，產(chǎn)品不能直接用于醫(yī)藥上。二、有機(jī)溶劑沉淀法

概念：許多有機(jī)溶劑能使溶于水的小分子生物物質(zhì)以及核酸、多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生沉淀作用。原理：A降低溶劑介電常數(shù)（介電常數(shù)D有機(jī)<D水）

，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，增加了酶、蛋白質(zhì)、核酸等帶電粒子之間的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。B破壞水化膜：由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞水化層，降低蛋白質(zhì)分子的溶劑化能力，破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)沉淀。C相反力：疏水基團(tuán)暴露并有機(jī)溶劑疏水基團(tuán)結(jié)合形成疏水層.有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理降低介電常數(shù)破壞水化膜1、pH值：

pH多控制在待沉蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。

2、有機(jī)溶劑的種類：介電常數(shù)低越低沉淀能力越強(qiáng)①用于生物物質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑須能與水互溶，但對(duì)蛋白無(wú)作用；②乙醇是核酸、糖類、氨基酸和核苷酸等物質(zhì)最常用的沉淀劑；③乙醇與水混合時(shí)溶液溫度顯著升高，這對(duì)熱穩(wěn)定性較差的產(chǎn)物影響較大。3、無(wú)機(jī)鹽的離子強(qiáng)度：較低濃度的中性鹽存在有利于沉淀作用，減少蛋白質(zhì)變性。中性鹽濃度以0.01～0.05mol/L為好。有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素4、溫度

使用有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，操作必須在低溫下進(jìn)行。有機(jī)溶劑與水混合時(shí)，溶液的溫度顯著升高，增加有機(jī)溶劑對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用，有機(jī)溶劑要緩緩加入，防止溶液局部升溫溫度會(huì)影響蛋白質(zhì)的沉淀能力，一般溫度越低，沉淀越完全。因此，所用的有機(jī)溶劑須預(yù)先冷卻到-10－-20℃；在使用有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)在低溫下進(jìn)行。5、金屬離子：一些金屬離子如Ca2+、Zn2+等可與某些成陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶劑用量。6.生物分子濃度：樣品較稀時(shí)，將增加有機(jī)溶劑投入量和損耗；樣品太濃會(huì)增加共沉作用。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的初濃度以0.5～2％為好，粘多糖則以1～2％較合適。有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素

舉例：固體發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的提取工藝研究

α-淀粉酶（米曲霉）菌體+水過(guò)濾水抽提清液

加乙醇（70%）攪拌α-淀粉酶↓

*

pH影響

收率%酶活收率酶活

6.5pH

*

適宜的pH5.6~6.0

*

溫度影響

收率%酶活酶活

收率

1020T℃

*

適宜的溫度10~20℃

①分辨率比鹽析法高，一種溶質(zhì)只在比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀；②沉淀無(wú)需脫鹽，有機(jī)溶劑容易揮發(fā)除去，并可以回收，產(chǎn)品純度高；③有機(jī)溶劑密度低，易進(jìn)行固-液分離。有機(jī)溶劑沉淀法的缺點(diǎn)是易引起蛋白變性，操作常需低溫進(jìn)行；大量采用有機(jī)溶劑，成本較高；易燃、易爆。有機(jī)溶劑沉淀法優(yōu)點(diǎn)等電點(diǎn)沉淀法在低的離子強(qiáng)度下，調(diào)pH至等電點(diǎn)，使蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水力能使分子間相互吸引，形成沉淀的操作稱為等電點(diǎn)沉淀。不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。生產(chǎn)胰島素時(shí)，在粗提液中先調(diào)pH8.0去除堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)pH3.0去除酸性蛋白質(zhì)。

pH=pI圖16-10表示大豆蛋白的溶解度隨pH的變化情況。等電點(diǎn)沉淀法非離子型聚合物用聚乙二醇等非離子性聚合物亦能降低蛋白質(zhì)的溶解度，有選擇性的沉淀蛋白質(zhì)。機(jī)理：與有機(jī)溶劑相似，能降低水活度，破壞蛋白質(zhì)的水化膜。常用非離子性聚合物(PEG)：

是一種水溶性的高分子聚合物，分子量4,000以上的PEG可以用來(lái)沉淀蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：1.沉淀效能高2.操作條件溫和，不易引起生物大分子變性3.顆粒大，沉淀后易除去4.無(wú)毒、不可燃

5.廣泛用于核酸、蛋白等的分離純化。成鹽沉淀法此類沉析劑有以下兩種：（1）金屬離子：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+等與酸性基團(tuán)結(jié)合；（2）有機(jī)酸：苦味酸鹽、鞣質(zhì)等，與堿性基團(tuán)結(jié)合缺點(diǎn)：容易導(dǎo)致活性蛋白的不可逆變性，需采用較溫和的條件，有時(shí)還需加入一定的穩(wěn)定劑。１）金屬離子沉淀金屬離子的沉淀作用是由于它們能與蛋白質(zhì)分子中的特殊部位起反應(yīng)造成的。例如鋅易與組胺酸殘基中咪唑基結(jié)合，從而降低蛋白質(zhì)的溶解度。金屬離子在蛋白質(zhì)分級(jí)沉淀上的應(yīng)用可以追溯到1905年，真正的認(rèn)識(shí)是后來(lái)從金屬離子與純血漿蛋白的特異相互作用的研究中得到的。Zn2+用于沉淀?xiàng)U菌肽、尿激酶和胰島素。Ca2+（CaCO3）用于分離乳酸，血清蛋白和檸檬酸。硫酸鋇在檸檬酸生產(chǎn)中用以去除重金屬高于，MgSO4用以去除DNA和其他核酸；成鹽類復(fù)合物沉淀金屬離子沉淀蛋白質(zhì)一般可分三類：①能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物強(qiáng)烈結(jié)合的一些金屬離子，如：Mn2+、

Fe2+

、Ｃo2+、

Ni2+

、Ｃu2+、

Zn2+、

Cd2+;②能與羧酸結(jié)合而不與含氮化合物結(jié)合的一些金屬離子，如：Ca2+

、Ba2+、

Mg2+、

Pb2+;③能巰基化合物強(qiáng)烈結(jié)合的一些金屬離子，如：Ｈg2+

、

Ag2+

、Pb2+。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，金屬離子的濃度常為0.02mol/L。復(fù)合物中金屬離子的去除，可用離子交換法或EDTA金屬螯合劑。六、其他沉淀方法（一）表面活性劑十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB）、十六烷基氯化吡啶（CPC）、十二烷基硫酸鈉（SDS）等離子型表面活性劑都可用于沉淀生物分子，CTAB用于沉淀酸性多糖，SDS多用于分離胰蛋白或核蛋白。選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法：選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀下來(lái)，而與目的物分開。原理：利用蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子對(duì)某些物理或化學(xué)因素敏感性不同，有選擇地使之變性沉淀，以達(dá)到分離提純的目的。方法可分為：1）利用對(duì)熱的不穩(wěn)定性,加熱破壞某些組分，而保存另一些組分；2）酸堿變性；3）利用表面活性劑(三氯乙酸)或有機(jī)溶劑引起變性。聚電解質(zhì)沉淀

機(jī)理：架橋與靜電離子型多糖聚合物，酸性多糖羧甲基纖維素、海藻酸鈉，食品蛋白的沉淀。合成的離子聚合物：聚丙烯酸（pH2.890%蛋白沉淀）聚苯乙烯季胺鹽（pH10.4,95%蛋白沉淀）聚甲基丙烯酸聚乙烯亞胺各種沉淀方法應(yīng)用范圍鹽析法：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。有機(jī)溶劑沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化，有時(shí)也用于蛋白質(zhì)沉淀。等電點(diǎn)沉淀法：用于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)的沉淀。但單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合使用。非離子多聚體沉淀法：用于分離生物大分子。生成鹽復(fù)合物沉淀：用于多種化合物，特別是小分子物質(zhì)的沉淀。選擇性沉淀（熱變性或酸堿變性沉淀）：多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。七、結(jié)晶法結(jié)晶是指物質(zhì)從液態(tài)（液體或熔融體）或氣態(tài)形成晶體的過(guò)程叫結(jié)晶。結(jié)晶純化分離方法歷史悠久，食鹽的分離純化最早就是采用結(jié)晶法分離純化的。生物制藥中結(jié)晶法常用于發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化。在待分離的樣品溶液中，若將所需物質(zhì)結(jié)晶沉淀，其余物質(zhì)仍然留在液體中則可達(dá)到分離純化目標(biāo)產(chǎn)物的目的。在結(jié)晶操作中，應(yīng)對(duì)生物物質(zhì)結(jié)晶形成的條件及形成速度進(jìn)行控制，以得到較好的分離效果。

第四節(jié)離心分離純化技術(shù)離心技術(shù)（centrifugaltechnique）是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)受到一個(gè)外向的離心力的行為而發(fā)展起來(lái)的一種分離技術(shù)。一、基本原理

（一）離心力（Fc）離心力（Fc）的大小等于離心加速度ω2X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：（二）相對(duì)離心力（RCF）RCF就是實(shí)際離心場(chǎng)轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。一、基本原理

（三）沉降系數(shù)（s）顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。（四）沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的距離。粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場(chǎng)增大，粒子的沉降速度也增加；而與溶劑液體粘度的18倍成反比。從該式中可看出，①當(dāng)ρP＞ρm，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當(dāng)ρP＝ρm，則S＝0，粒子到達(dá)某一位置后達(dá)到平衡。③當(dāng)ρP＜ρm，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。一、基本原理

（五）沉降時(shí)間（Ts）（六）K系數(shù)K系數(shù)是用來(lái)描述在一個(gè)轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來(lái)的效率。原則上，K系數(shù)愈小的，愈容易，也愈快將粒子沉降。

二、常用離心方法-差速離心法它利用不同的粒子在離心力場(chǎng)中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過(guò)不斷增加相對(duì)離心力，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分步沉淀。二、常用離心方法-速度區(qū)帶離心法根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的目的。操作時(shí)，離心前先在離心管內(nèi)裝入密度梯度介質(zhì)，在將待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，最后一起離心。二、常用離心方法-等密度離心法等密度離心法是在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，當(dāng)梯度液因離心力的作用，逐漸形成管底較濃而頂端較稀的密度梯度，與此同時(shí)原來(lái)分布均勻的粒子也發(fā)生重新分布。二、常用離心方法-梯度溶液的制備1.梯度材料的選擇原則常用的梯度材料有：①糖類②無(wú)機(jī)鹽類：CsCl（氯化銫）③有機(jī)碘化物④硅溶膠⑤蛋白質(zhì)⑥重水⑦非水溶性有機(jī)物⒉梯度材料的應(yīng)用范圍（1）蔗糖：是實(shí)驗(yàn)室常用于細(xì)胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細(xì)胞的分離。（2）聚蔗糖：主要用于分離各種細(xì)胞包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞等。（3）氯化銫：廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，但價(jià)格較貴。（4）鹵化鹽類：KBr和NaCl可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。（5）Percoll：可用于細(xì)胞、細(xì)胞器和病毒的分離。三、影響物質(zhì)顆粒沉降的因素1.固相顆粒大小及其與液相的密度差固體粒子越大，重量增加，其離心力越大，粒子越易沉淀；但若此時(shí)粒子粒子顆粒的密度小于液相的密度，則離子不易沉淀，反而漂浮在液體上方。2.固相顆粒形狀和濃度3.液體粘度和離心工作溫度溫度越高，液體粘度越低，分離效果越好，一般控制在4℃左右。4.液相中影響沉降的其它因素四、常用離心設(shè)備1.固相顆粒大小及其與液相的密度差固體粒子越大，重量增加，其離心力越大，粒子越易沉淀；但若此時(shí)粒子粒子顆粒的密度小于液相的密度，則離子不易沉淀，反而漂浮在液體上方。2.固相顆粒形狀和濃度3.液體粘度和離心工作溫度溫度越高，液體粘度越低，分離效果越好，一般控制在4℃左右。4.液相中影響沉降的其它因素可分為人工卸料、自動(dòng)間歇排料、噴嘴連續(xù)排料三種。前兩種適合于懸浮液固形顆粒含量較少的場(chǎng)合。間歇式操作，固相干度較好；而連續(xù)操作固相含液量較大，固相仍然具有流動(dòng)性。碟片式離心機(jī)適用于細(xì)菌、酵母菌、放線菌等多種微生物細(xì)胞懸浮液及細(xì)胞碎片懸浮液的分離。它的生產(chǎn)能力較大，最大允許處理量達(dá)300m3／h，一般用于大規(guī)模的分離過(guò)程。四、常用離心設(shè)備-碟片式離心機(jī)碟片式離心機(jī)工作原理當(dāng)懸浮液在動(dòng)壓頭的作用下，經(jīng)中心管流入高速旋轉(zhuǎn)的碟片之間的間隙時(shí)，便產(chǎn)生了慣性離心力，其中密度較大的固體顆粒在離心力作用下向上層碟片的下表面運(yùn)動(dòng)，而后在離心力作用下被向外甩出，沿碟片下表面向轉(zhuǎn)子外圍下滑，而液體則由于密度小，在后續(xù)液體的推動(dòng)下沿著碟片的隙道向轉(zhuǎn)子中心流動(dòng)，然后沿中心軸上升，從套管中排出，達(dá)到分離的目的

管式離心機(jī)特別適合于一般離心機(jī)難以分離而固形物含量<1％的發(fā)酵液的分離。其設(shè)備簡(jiǎn)單，操作穩(wěn)定，分離效率高。但其生產(chǎn)能力較小，一般轉(zhuǎn)速相對(duì)較低的管式離心機(jī)最大處理量為10m3／h。且不適用與固形物含量較高的發(fā)酵液。

四、常用離心設(shè)備-管式離心機(jī)

它靠離心力和螺旋的推進(jìn)作用自動(dòng)連續(xù)排渣，因而也稱為螺旋卸料沉降離心機(jī)。其優(yōu)點(diǎn)為：具有操作連續(xù)、適應(yīng)性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣、結(jié)構(gòu)緊湊和維修方便等優(yōu)點(diǎn)，特別適合于分離含固形物較多的懸浮液，但不適合細(xì)菌、酵母菌等微小微生物懸浮液的分離。此外，液相的澄清度也相對(duì)較差。四、常用離心設(shè)備-傾析式

四、常用離心設(shè)備選擇第五節(jié)過(guò)濾及過(guò)濾分離技術(shù)

過(guò)濾（filtration）是借助于一種能將固體物截留而讓流體通過(guò)的多孔介質(zhì)，將固體物從液體或氣體中分離出來(lái)的一種化工單元操作過(guò)程。過(guò)濾操作是借助于多孔介質(zhì)，在一定的壓力差ΔP作用下，使懸浮液中的液體通過(guò)介質(zhì)的孔道，而固體顆粒被截留在介質(zhì)上，從而實(shí)現(xiàn)固液分離的單元操作。過(guò)濾介質(zhì)filtermedium

:過(guò)濾采用的多孔物質(zhì)；濾漿filterpulp

:所處理的懸浮液；濾液filtrate

:通過(guò)多孔通道的液體；濾餅或?yàn)V渣filtercake:被截留的固體物質(zhì)。一、過(guò)濾原理與分類

一、過(guò)濾原理與分類

濾餅過(guò)濾深層過(guò)濾產(chǎn)生壓力差的方法：①利用濾漿自身的壓頭；②在濾漿表面加壓；③在過(guò)濾介質(zhì)的下游一側(cè)抽真空；④利用慣性離心力。一、過(guò)濾原理與分類

過(guò)濾目的：①過(guò)濾澄清是指用物理阻留的方法去除細(xì)胞組織勻漿或粗制提取液中的細(xì)胞碎片等各種顆粒性雜質(zhì)。②過(guò)濾除菌則能除去溶液中的微生物，且不影響溶液中藥物成分的活性。

二、過(guò)濾介質(zhì)

過(guò)濾介質(zhì)的主要作用是支撐濾餅，須具有多孔結(jié)構(gòu)、足夠的機(jī)械強(qiáng)度和盡可能小的流動(dòng)阻力、耐腐蝕性。

三、助濾劑

將某些堅(jiān)硬的粒狀物預(yù)涂于過(guò)濾介質(zhì)表面或加入濾漿中，可形成較為堅(jiān)硬而松散的濾餅，使濾液能夠順利通過(guò)，這種粒狀物稱為助濾劑。硅藻土為較純二氧化硅礦石，其化學(xué)性能穩(wěn)定，具有極大的吸附和滲透能力，是良好的介質(zhì)和助濾劑。使用方法有：(1)作為深層過(guò)濾介質(zhì)，可以過(guò)濾含少量(＜0.1％)懸浮固形物的液體。(2)在濾布表面上預(yù)涂硅藻土薄層，保護(hù)濾布的毛細(xì)孔道在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不被懸浮液中的固體粒子所堵塞