第八章 酶的固定化

不穩(wěn)定：在高溫、高壓、強酸、強堿下易失活，即使在最適條件下反應(yīng)；2.回收困難，不能重復(fù)使用：經(jīng)濟上不合算；3.反應(yīng)速度減慢，不容易與毒副分子和產(chǎn)物分離。

游離酶的不足：什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固相酶、固定化酶）固定化技術(shù)

固定化酶：固定在一定載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行催化反應(yīng)的酶。酶的固定化固定化酶的優(yōu)點增加酶穩(wěn)定性，可反復(fù)或連續(xù)使用，提高使用效率，降低成本易于和反應(yīng)產(chǎn)物分開，產(chǎn)物溶液無酶殘留，簡化提純工藝酶反應(yīng)過程可嚴格控制較游離酶更適合多酶反應(yīng)增加產(chǎn)物收率，提高產(chǎn)物質(zhì)量5.1.1酶的固定化方法微囊型固定化方法吸附法結(jié)合法交聯(lián)法包埋法網(wǎng)格型共價鍵結(jié)合法離子鍵結(jié)合法B.半透膜包埋法(微囊）：

將酶或細胞包埋于由各種高分子聚合物（直徑幾十微米～幾百微米，厚約25mm的半透膜）制成的小球內(nèi)，制成固定化酶或固定化細胞。(適用于產(chǎn)物、底物分子量小的）①常用載體———半透膜有：聚酰胺膜、火棉膠膜②制備方法：將酶液滴分散在與水互不相溶的有機溶劑中，再在酶液滴表面形成半透膜，將酶包埋在微膠囊之中。

四、交聯(lián)法：借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。交聯(lián)的形式：（1）酶直接交聯(lián)法（2）酶與輔助蛋白交聯(lián)法各種固定化方法的優(yōu)缺點比較各種酶固定化方法的比較5.1.3固定化酶的特性

（1）酶的活性：通常低于天然酶（有例外）。

（2）酶的穩(wěn)定性

酶的熱穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性以及對變性劑、抑制劑、蛋白酶的抵抗力增加。

可能的原因：①固定化增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度，可防止酶分子伸展變形；②抑制酶的自身降解。③固定化部分阻擋了外界不利因素對酶的侵襲。

（3）酶的最適溫度

最適溫度變化不大。有些酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升（有例外）。（4）酶的最適pHa.載體性質(zhì)的影響b.產(chǎn)物性質(zhì)對最適pH值的影響帶負電荷載體：產(chǎn)物為酸性：最適pH值高一些；

最適pH向堿性偏移。產(chǎn)物為堿性：最適pH值低一些；帶正電荷載體：

產(chǎn)物為中性：最適pH值一般不改。最適pH向酸性偏移。

（5）米氏常數(shù)

米氏常數(shù)Km反映了酶與底物的親和力。使固定化酶Km變動的原因，主要是由于載體與底物間靜電相互作用。

固定化載體與底物電荷相反，固定化酶的表觀Km值降低。固定化載體與底物電荷相同，固定化酶的表觀Km值顯著增加。

（6）底物特異性

作用于低分子底物的酶特異性沒有明顯變化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特異性往往會變化。1.同一批固定化酶能在工藝流程中重復(fù)多次的使用；2.易與底物、產(chǎn)物分開有利于控制生產(chǎn)過程；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；3.在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性；4.較能適應(yīng)于多酶反應(yīng)；5.

提供了研究酶動力學(xué)的良好模型。固定化酶的優(yōu)點（與游離酶比較）：固定化酶的缺點：（1）酶固定化時酶的活力有所損失。（2）增加了固定化的成本，使工廠開始投資大。（3）比較適應(yīng)水溶性底物和小分子底物。（4）與完整細胞比較，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子的反應(yīng)，同時對胞內(nèi)酶需經(jīng)分離后，才能固定化。

5.2細胞固定化

固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進行生命活動（生長、繁殖、新陳代謝）的細胞。固定化細胞的分類原因之一:細胞壁對物質(zhì)擴散的障礙原生質(zhì)體微生物細胞和植物細胞除去細胞壁后就可獲得(1)保護了原生質(zhì)體(2)利于氧的傳遞、營養(yǎng)成分的吸收和胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌一般采用網(wǎng)格包埋法（即凝膠包埋法）。常用凝膠：瓊脂凝膠，海藻酸鈣凝膠，角叉菜膠和光交聯(lián)樹脂。注意：一般要加滲透壓穩(wěn)定劑，以防止原生質(zhì)體破裂。

5.3原生質(zhì)體固定化（二）固定化原生質(zhì)體的特點有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌穩(wěn)定性好有利于產(chǎn)物的分離純化需添加滲透壓穩(wěn)定劑1．固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用現(xiàn)已用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化酶主要有：氨基?；钙咸烟钱悩?gòu)酶天門冬氨酸酶青霉素酰化酶延胡索酸酶β－半乳糖苷酶天門冬氨酸-β-脫羧酶脂肪酶植酸酶

5.5固定化酶的應(yīng)用18/1382.固定化酶在酶傳感器方面的應(yīng)用酶傳感器是由固定化酶與能量轉(zhuǎn)換器（電極、場效應(yīng)管、離子選擇場效應(yīng)管等）密切結(jié)合而成的傳感裝置，是生物傳感器的一種。廣泛用于臨床診斷、工業(yè)發(fā)酵過程控制和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。生物傳感器原理圖本