第三章 細胞生物學研究方法1

第三章細胞生物學研究方法進行初步觀察形成可驗證的假說設計對照試驗收集資料解釋結(jié)果作出合理結(jié)論查閱已有知識生物學研究模式生物不同物種享有共同分子機制CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana細胞破碎細胞器組份形態(tài)觀察細胞培養(yǎng)離心分離染色免疫技術分子生物學標記掌握各種顯微鏡的用途、幾種細胞組分的主要分析方法的原理及技術、細胞培養(yǎng)及細胞融合的方法了解電子顯微鏡的觀察方法及顯微操作技術的基本原理。教學目的、要求本章內(nèi)容提要第一節(jié)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法第二節(jié)細胞及其組分的分析方法第三節(jié)細胞培養(yǎng)與細胞工程

第一節(jié)

細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法1cm1mm100um10um1um100nm10nm1nm0.1nm光學顯微鏡電子顯微鏡掃描隧道顯微鏡肉眼分辨率：0.2mm光學顯微鏡分辨率：0.2μm

電子顯微鏡分辨率：0.2nm幾種顯微鏡的分辨范圍一、光學顯微鏡1.普通復式光學顯微鏡2.熒光顯微鏡4.激光共焦點掃描顯微境3.暗視野顯微鏡5.相差顯微鏡偏光顯微鏡6.微分干涉差顯微鏡7.倒置顯微鏡各種光學顯微鏡的特性比較當代顯微鏡的發(fā)展趨勢普通生物顯微鏡由三部分構(gòu)成：照明系統(tǒng)光學放大系統(tǒng)機械裝置原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。1.普通復式光學顯微鏡分辨率N=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（標本對物鏡鏡口的張角鏡口角總是要小于140?，所以sina/2的最大值必然小于1。分辨力數(shù)值不會小于0.2μm，人眼的分辨力為0.2mm,因此顯微鏡的最大設計倍數(shù)為1000X。指顯微鏡能分辨物體最小間隔的能力。0.61λ分辨率DN.sin（α/2）=樣品的制作制片：固定（甲酫）、包埋（石蠟）切成厚約5μm的薄片以便觀察。染色：伊紅和美藍特異地與不同蛋白質(zhì)結(jié)合，品紅特異地顯示DNA的所在部位。2.熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope特點：光源為短波光(紫外光)；有兩個特殊的濾光片；用一定波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光原理:利用一定波長的光,照射被檢樣品,激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出可見的熒光,視場中所見像主要是樣品的熒光映像.自發(fā)熒光:生物體內(nèi)有些物質(zhì)受激發(fā)光照射后可直接發(fā)出的熒光.木質(zhì)素,葉綠素次發(fā)熒光:標本本身不發(fā)熒光，經(jīng)熒光染料處理后,那些對熒光染料有選擇性吸收的部分經(jīng)激發(fā)后發(fā)出的熒光.常用熒光物質(zhì)：酸性品紅，甲基綠，中性紅，EB等。4.激光共焦點掃描顯微境（laserscanningconfocalmicroscopy,LCSM

）共焦點是指物鏡和聚光鏡同時聚焦到同一個小點，即它們互相共焦點。LCSM

激光光源通過一個微小縫隙，打到一個二向色鏡。由鏡子反射的光線通過物鏡、聚焦在樣品的一個層面上。樣品被激發(fā)后發(fā)出較長波長的光，通過物鏡成像、聚焦在顯微鏡中的一個針孔縫隙中，而來自其它層面的光線被擋板擋住。圖像通過信號放大傳輸?shù)接嬎銠C中。LCSM照片，藍色為細胞核，綠色為微管比普通熒光顯微鏡的分辨率提高1.4-1.7倍。由于可自動改變觀察的焦平面而且縱向分辨率（axialresolution）得到改善，所以可以通過“光學切片”觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。將改變焦點獲得一系列細胞不同切面上的圖像，經(jīng)疊加后便可重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)。相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)FritsZernike1953年Nobel物理學獎1.分離直射光和衍射光2.使直射光和衍射光之間產(chǎn)生干涉，使相位差變成振幅差,表現(xiàn)為明與暗的對比秀麗桿線蟲C.elegans——用于觀察未染色樣品,能夠觀察到無色透明的活的物體。相差顯微鏡基本原理：把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處：環(huán)形光闌(annular

diaphragm)相位板(annularphaseplate)A+相板B+相板5.微分干涉差顯微鏡Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）1952年Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。更適合研究活細胞中較大的細胞器。組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。6.倒置顯微鏡顯微鏡用途分辨率普通顯微鏡適于一般性生物的觀察，操作方便不小于0.2μm熒光顯微鏡觀察可發(fā)熒光的物質(zhì)，可定性定量高于普通顯微鏡倒置顯微鏡多用于觀察活細胞，具有相差物鏡與普通顯微鏡相同激光共焦點掃描顯微鏡顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)，也可以用于細胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細胞形態(tài)的測量比普通顯微鏡提高1.4-1.7倍微分干涉差顯微鏡能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像，目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進行，可觀察活細胞中的顆粒及細胞器的運動普通顯微鏡10倍以上相差顯微鏡可以觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞-各種光學顯微鏡的比較當代顯微鏡的發(fā)展趨勢采用組合方式集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體。自動化與電子化。二、電子顯微鏡技術透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡1.原理：以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達百萬倍。用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2μm）。用于電鏡的標本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。（一）、透射電子顯微鏡電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區(qū)別

分辨本領光源透鏡真空成像原理

利用樣品對波長的吸光學0.2μm左右可見光收形成明暗反差和顏顯微鏡放大倍數(shù)1000×400-700nm玻璃不要求色變化100nm紫外光電子利用樣品對電子的顯微鏡0.1-0.2nm電子束

0.01-0.9nm

電磁要求

散射和透射形成明暗反差電鏡需要真空的原因:1.如果含有其他分子,會與電子發(fā)生碰撞,使電子散射,影響成像質(zhì)量,2.碰撞也會使電子束不穩(wěn)定,產(chǎn)生閃爍現(xiàn)象,3.灼熱的燈絲遇氣體易腐蝕和斷裂.2、制樣技術超薄切片負染技術冰凍蝕刻電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機ultramicrotome）制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。超薄切片Page59超薄切片技術主要包括取材、固定、包埋、切片、染色等步驟。Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.Thecellwall,nucleus,vacuoles,mitochondria,endoplasmicreticulum,Golgiapparatus,andribosomesareeasilyseen.負染技術用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負染效果，分辨力可達1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteriaNegativeStainedActin冷凍蝕刻freeze-etching標本置于干冰（-78.5攝氏度）或液氮（-196攝氏度）中冰凍。用冷刀驟然將標本斷開，然后升溫，冰升華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴涂一層蒸汽鉑和碳。然后用次氯酸鈉將組織溶掉，把鉑和碳的膜剝下來，此膜即為復膜（replica）。Page61酵母細胞4.電鏡三維重構(gòu)技術該技術是電子顯微術、電子衍射與計算機圖像處理相結(jié)合而形態(tài)的具有重要應用前景的一門新技術，尤其適于分析難以形成三維晶體的膜蛋白以及病毒和蛋白質(zhì)-核酸復合物等大的復合體的三維結(jié)構(gòu)。掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）于20世紀60年代問世，用來觀察標本的表面結(jié)構(gòu)。（二）、掃描電子顯微鏡工作原理

用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關，也就是說與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?，再?jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸?，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。antigen-presentingcells，APCs掃描電鏡電鏡光鏡總體形態(tài)顏色內(nèi)部結(jié)構(gòu)

表面形態(tài)

三、掃描隧道顯微鏡

掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope，STM）

由Binnig等1981年發(fā)明，根據(jù)量子力學原理中的隧道效應而設計。

利用掃描隧道顯微鏡直接觀察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)等分子的原子布陣和某些生物結(jié)構(gòu)，如生物膜、細胞壁等的原子排列分辨率：橫向為0.1~0.2nm，縱向可達0.001nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進行觀察。

STMimageofaDNAmolecule細胞組分分析物理方法化學方法免疫學方法分子生物學方法離心組織染色流式細胞細胞電泳免疫標記放射性自顯影吸收光譜第二節(jié)、細胞組分的分析方法一、離心技術是分離細胞器及各種大分子基本手段。轉(zhuǎn)速為10~25kr/min的離心機稱為高速離心機。轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機。超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100000r/min，離心力超過500Kg。1.差速離心Differentialcentrifugation特點：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級離心。用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。沉降順序：核——線粒體——溶酶體與過氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體——核蛋白體。可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再進行分離純化。利用肝臟制備各種亞細胞組分的制備離心過程示意圖勻漿物肝臟上清夜完整細胞完整細胞1000g20min核線粒體溶酶體過氧化物酶體微粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)100000g120min105000g20minDNase靜置20min10000g20min核糖體2.密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細胞和細胞成分分層、分離。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。

速度沉降velocitysedimentation

用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。特點：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。等密度沉降isopycnicsedimentation用途：分離密度不等的顆粒。特點：介質(zhì)密度高，陡度大，介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。力場比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速離心。原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的成分分離。差速離心密度梯度離心CsCl密度梯度離心蔗糖密度梯度離心低速離心中速離心高速離心超高速離心細胞勻漿細胞核仁細胞骨架大細胞器小細胞器核糖體大分子離心樣品蔗糖的穩(wěn)定梯度慢速沉降成分快速沉降成分分畫樣品蔗糖的不連續(xù)梯度低浮力密度成分高浮力密度成分二者結(jié)合二、細胞組分顯示方法組織化學或細胞化學染色（histochemicalorcytochemicalstaining）是利用染色劑可同細胞的某種成分發(fā)生反應而著色的原理，對某種成分進行定性或定位研究的技術。利用這種方法對細胞的各種成分幾乎都能顯示，包括有機物、醛、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、酶等。1.固定物理固定：血膜空氣快速干燥、冷凍干燥?；瘜W固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。

步驟：2.顯示方法金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應產(chǎn)物最終生成CuS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。Schiff反應：細胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應）。聯(lián)苯胺反應：過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。茚三酮反應：顯示蛋白質(zhì)。金屬沉淀法Schiff反應聯(lián)苯胺反應脂溶染色法E.茚三酮反應：顯示蛋白質(zhì)。F.米倫（Millon）染色：顯示蛋白質(zhì)（紅色）酪氨酸殘基與氮汞試劑反應免疫細胞化學是根據(jù)免疫學原理，利用抗體同特定抗原結(jié)合，對抗原進行專一定位測定的技術。如果將抗體結(jié)合上標記物，再與組織中的抗原發(fā)生反應，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位。免疫細胞化學(immunocytochemistry)三、特異蛋白抗原的定位與定性抗體與抗原的結(jié)合方法可分為以下兩種：直接法間接法將帶有標記的抗體與抗原反應，顯示出抗原存在的部位在抗體抗原初級反應的基礎上，再用帶標記的次級抗體與初級抗體反應，從而使初級反應得到放大，增強顯示效果間接免疫細胞化學法的原理示意圖次級抗體初級抗體標記物第一抗體（一抗）第二抗體（二抗）三、特異蛋白抗原的定位和定性1.免疫熒光技術Immunofluorescencetechnique：抗原-抗體特異結(jié)合與熒光標記技術相結(jié)合用于研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。用Alexa488標記的抗人α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細胞核:紅色,DAPI染色(常規(guī)熒光顯微鏡照片，ShiQinghua等)用抗α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細胞核:紅色,DAPI染色(激光共聚焦顯微鏡照片)2.免疫電鏡技術Immuneelectronmicroscopy：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等

用免疫電鏡方法,觀察到寇氏隱甲藻的多條凝集染色體和細胞中的金顆粒,并且細胞核內(nèi)、核膜上的金顆粒簇集相對于胞質(zhì)中相對集中,指示了ACA抗CJFD2003

四、細胞內(nèi)特異核酸序列的定位與定性通常用*原位雜交：指用標記的核酸探針通過分子雜交確定特異核苷酸序列在染色體上或者在細胞中的位置的方法。五、放射自顯影術用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。原理：將放射性同位素標記的化合物導入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。一般用14C和3H標記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。1.流式細胞技術用途：對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計（flowcytometer）。六、定量細胞化學分析技術2.顯微光譜分析技術細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線?？衫蔑@微分光光度計對某些成分進行定位、定性和定量測定。第三節(jié)細胞培養(yǎng)與細胞工程一、細胞培養(yǎng)二、細胞工程細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng)群體細胞培養(yǎng)克隆細胞培養(yǎng)組織培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)病毒一、細胞培養(yǎng)(一)、動物細胞培養(yǎng)選用最佳生存條件對活細胞進行培養(yǎng)和研究的技術。動物細胞的生存環(huán)境與植物細胞差別很大，因而二者的培養(yǎng)方法很不相同。(一)、動物細胞培養(yǎng)1.基本概念原代細胞(primaryculturecell)

從動物機體取出的進行培養(yǎng)的細胞群。有人也把培養(yǎng)的第2代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞統(tǒng)稱為原代培養(yǎng)細胞。