【課件】1.2微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用人教版（2019）高中生物選擇性必修3

第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用向經(jīng)過殺菌處理的牛奶中添加某些對人體有益的細(xì)菌,再經(jīng)過發(fā)酵就可以制成酸奶。由于制作工藝并不復(fù)雜，一些人會在家里自制酸奶。自制酸奶雖然方便，但是食用自制酸奶導(dǎo)致腸胃不適的事例屢見不鮮，主要原因是在制作過程中有雜菌混入。那么，怎樣才能保證無處不在的雜菌不混入發(fā)酵物中呢?從社會中來應(yīng)該先對制作用具和原料進(jìn)行滅菌處理，再接種純的菌種，并控制發(fā)酵條件，避免雜菌進(jìn)入。一微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)一、培養(yǎng)基的配制1．培養(yǎng)基的概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。2．作用：用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。3．培養(yǎng)基種類固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基加入凝固劑(如瓊脂)(1)固體培養(yǎng)基中的瓊脂僅作為凝固劑，不能為微生物生長提供能量和碳源。(2)病毒為非細(xì)胞結(jié)構(gòu)生物，只能在活細(xì)胞中營寄生生活，目前不能利用人工培養(yǎng)基來培養(yǎng)。4．培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成(1)主要營養(yǎng)物質(zhì)：水、碳源(提供碳元素的物質(zhì))、氮源(提供氮元素的物質(zhì))和無機鹽。(2)某種常見的細(xì)菌培養(yǎng)基——牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成組分含量提供的主要營養(yǎng)牛肉膏5g碳源、磷酸鹽和維生素等蛋白胨10g氮源和維生素等NaCl5g無機鹽H2O定容至1000mL水(3)還需滿足微生物對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及O2的需求。例如：①在培養(yǎng)乳酸桿菌時，需要在培養(yǎng)基中添加維生素；②在培養(yǎng)霉菌時，一般需要將培養(yǎng)基調(diào)至酸性；③在培養(yǎng)細(xì)菌時，一般需要將培養(yǎng)基調(diào)至中性或弱堿性；④在培養(yǎng)厭氧微生物時，需要提供無氧的條件。二、無菌技術(shù)獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染，主要包括消毒和滅菌。1．消毒(1)概念：指使用較為溫和的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物。(2)適用對象：操作的空間、操作者的衣著和手等。(3)常用方法：煮沸消毒、巴氏消毒等。項目主要方法應(yīng)用范圍消毒巴氏消毒法62～65℃消毒30min或80～90℃處理30s～1min牛奶、啤酒、果酒和醬油等不耐高溫的液體煮沸消毒法100℃煮沸5～6min家庭餐具等生活用品紫外線消毒30W紫外燈照射30min(損傷細(xì)菌的DNA)接種室、接種箱或超凈工作臺化學(xué)藥劑消毒用體積分?jǐn)?shù)為70%～75%的乙醇、碘酒皮膚、傷口、動植物組織表面消毒、空氣、手術(shù)器械、塑料或玻璃器皿消毒的主要方法及應(yīng)用范圍2．滅菌(1)概念：指使用強烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。(2)適用對象：用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等。(3)常用方法：濕熱滅菌、干熱滅菌和灼燒滅菌等。項目主要方法應(yīng)用范圍滅菌灼燒滅菌直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒涂布器、接種環(huán)、接種針或其他金屬用具，試管口或瓶口等干熱滅菌干熱滅菌箱中，160～170℃的熱空氣中維持2～3h耐高溫的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿、金屬用具等高壓蒸汽滅菌(濕熱滅菌)100kPa、121℃維持15～30min培養(yǎng)基等滅菌的主要方法及應(yīng)用范圍3.比較消毒和滅菌項目消毒滅菌作用強度較為溫和強烈的物理、化學(xué)因素消滅微生物的數(shù)量物體表面或內(nèi)部一部分微生物物體內(nèi)外的所有微生物能否消滅芽孢、孢子消滅部分芽孢能消滅全部芽孢和孢子適用對象操作空間、操作者的衣著和手等接種環(huán)、接種針、玻璃器皿、培養(yǎng)基等常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、化學(xué)藥劑消毒法、紫外線消毒法灼燒滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌三、微生物的純培養(yǎng)1．概念：由單一個體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養(yǎng)物，獲得純培養(yǎng)物的過程就是純培養(yǎng)。2．步驟微生物的純培養(yǎng)包括配制培養(yǎng)基、滅菌、接種、分離和培養(yǎng)等步驟。探究·實踐酵母菌的純培養(yǎng)(一)原理：微生物群分散或稀釋成單個細(xì)胞，單個細(xì)胞繁殖成單個菌落。菌落：分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，這就是菌落。(二)方法：采用平板劃線法和稀釋涂布平板法將單個微生物分散在固體培養(yǎng)基上，之后經(jīng)培養(yǎng)得到的單菌落一般是由單個微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。(三)步驟(1)制備培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基→滅菌→倒平板。倒平板注意事項：①溫度：50℃左右；②操作：在酒精燈火焰附近；③冷凝后平板倒置。既可以防止水分過快蒸發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染?？梢杂檬钟|摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可。(1)如果需要調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，應(yīng)該在定容完成后，滅菌之前進(jìn)行操作。(2)培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到50℃左右時開始倒平板。其原因是瓊脂是一種多糖，在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，倒平板時高于50℃會燙手，低于50℃時，若不及時操作，瓊脂會凝固。(3)倒平板時，要使錐形瓶的瓶口迅速通過火焰。通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。(4)平板冷卻凝固后，要將平板倒置。(5)在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，那么這個平板不能用來培養(yǎng)微生物，因為空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。配制培養(yǎng)基的注意事項(2)接種和分離酵母菌通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。經(jīng)過數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到單菌落。(1)接種前將接種環(huán)放在酒精燈火焰上灼燒。(2)劃線操作在酒精燈火焰旁進(jìn)行。(3)接種環(huán)蘸取菌液前后，要將試管口通過火焰。(4)劃線時將培養(yǎng)皿的皿蓋打開一條縫隙，用接種環(huán)在培養(yǎng)基表面迅速劃線，劃線后及時蓋上皿蓋。平板劃線法接種菌種時，可防止雜菌污染的操作(1)培養(yǎng)未接種的培養(yǎng)基的目的是檢測培養(yǎng)基是否被雜菌污染(或檢查培養(yǎng)基制備是否合格)。未接種的培養(yǎng)基表面若有菌落生長，則說明培養(yǎng)基被污染，應(yīng)該重新制備；若無菌落生長，則說明未被污染。(2)在接種酵母菌的培養(yǎng)基上可觀察到獨立的菌落，這些菌落在顏色、形狀和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。(3)若在培養(yǎng)基中觀察到不同形態(tài)的菌落，原因可能是菌液不純，混入其他雜菌，或在實驗操作過程中被雜菌污染。(3)培養(yǎng)酵母菌完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。3．實驗結(jié)果的分析思考·討論1．為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？灼燒時期目的取菌種前殺死接種環(huán)上原有微生物每次劃線前殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數(shù)目逐漸減少，直至得到單個細(xì)胞接種結(jié)束后殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者2.若要按照如圖進(jìn)行劃線，那么在接種劃線的操作過程中，共灼燒了幾次接種環(huán)？思考·討論圖中共劃了5個區(qū)域，在每次劃線前后均需要對接種環(huán)灼燒滅菌，因此共需要灼燒接種環(huán)6次。3.為什么最后一次劃線與第一次的劃線不能相連？最后一次劃線已經(jīng)將細(xì)菌稀釋成單個的細(xì)胞，如果與第一次劃線相連則增加了細(xì)菌的數(shù)目，得不到純化的效果。思考·討論4.設(shè)置未接種平板組的意義是什么？通過觀察未接種平板是否有菌落存在以確定培養(yǎng)基是否被污染或滅菌是否徹底。劃線后，線條末端酵母菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使酵母菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)胞繁殖而來的菌落。5.在第二次以及其后的劃線操作時，總是從上一次劃線的末端開始劃線的原因是什么？二微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)一、選擇培養(yǎng)基1．自然界中目的菌的篩選(1)實例：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中用到的耐高溫的DNA聚合酶，就是從熱泉中篩選出來的水生棲熱菌中提取出來的。(2)依據(jù)：水生棲熱菌能在70～80℃的高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。2.實驗室中目的菌的篩選①原理：人為提供有利于目的菌生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度和pH等)，同時抑制或阻止其他微生物的生長。②方法：利用選擇培養(yǎng)基分離。選擇培養(yǎng)基：允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基二、微生物的選擇培養(yǎng)1.方法：對樣品進(jìn)行充分稀釋，然后將菌液涂布到制備好的選擇培養(yǎng)基上。2.稀釋涂布平板法的操作過程(1)系列稀釋操作①編號為1×102～1×107試管中分別盛有9mL無菌水。②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。③取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。1mL1mL1mL1mL1mL1mL9mL無菌水取菌液涂布器消毒涂布器滅菌涂布平板(2)涂布平板操作1mL1mL1mL1mL1mL9mL無菌水待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d。3.培養(yǎng)：三、微生物的數(shù)量測定1.稀釋涂布平板法(1)原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。(2)計數(shù)原則：一般選擇菌落數(shù)為30～300的平板進(jìn)行計數(shù)。在一同稀釋度下，應(yīng)至少對3個平板進(jìn)行重復(fù)計數(shù)，然后求出平均值。(3)結(jié)果分析：統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目少，這是因為當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示。2.顯微鏡直接計數(shù)法(1)原理利用特定的細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)胞計數(shù)板，在顯微鏡下觀察、計數(shù)，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數(shù)量。(2)結(jié)果統(tǒng)計的結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和。比實際值大常用于相對較大的酵母菌細(xì)胞、霉菌孢子等的計數(shù)思考·討論1．通常1g土壤中有幾億到幾百億個土壤微生物，其中，細(xì)菌的數(shù)量最多，能分解尿素的細(xì)菌是其中的一部分。如何設(shè)計培養(yǎng)基的配方，從而將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來？設(shè)計一種選擇培養(yǎng)基，用尿素作為唯一氮源，可以將分解尿素的細(xì)菌分離出來。2．用平板劃線法接種培養(yǎng)結(jié)果的圖片如下。請結(jié)合圖片分析，平板劃線法能否達(dá)到對細(xì)菌進(jìn)行計數(shù)的目的？為什么？不能，平板劃線法最開始的劃線很可能菌類會長成一片，導(dǎo)致無法計數(shù)，此外灼燒接種環(huán)的時候也會殺死一部分菌類。3．當(dāng)菌液稀釋倍數(shù)足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個單菌落來源于一個活菌。用稀釋涂布平板法接種培養(yǎng)結(jié)果的圖片如下。與平板劃線法相比，為什么稀釋涂布平板法可以用于細(xì)菌的計數(shù)？思考·討論稀釋涂布平板法會進(jìn)行等比稀釋，在合適的稀釋倍數(shù)下，均勻涂布得到的菌落互不接觸，可以確定菌類的密度，再通過計算可以得知原液的菌落數(shù)。4．通過稀釋涂布平板法統(tǒng)計的細(xì)菌的數(shù)目與它的實際數(shù)目相同嗎？統(tǒng)計的細(xì)菌數(shù)往往比活菌實際數(shù)目低。因為當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。5．對稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數(shù)法進(jìn)行比較項目顯微鏡直接計數(shù)法稀釋涂布平板法主要用具顯微鏡、血細(xì)胞計數(shù)板或細(xì)菌計數(shù)板等培養(yǎng)基等計數(shù)依據(jù)菌株本身培養(yǎng)基上的菌落數(shù)優(yōu)點計數(shù)方便、操作簡單計數(shù)的都是活菌缺點死菌、活菌都計數(shù)在內(nèi)操作復(fù)雜、有一定誤差探究·實踐土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)1.實驗原理絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌，該選擇培養(yǎng)基的配方見右欄。組分含量KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0gH2O定容至1000mL2.方法步驟(1)土壤取樣在酸堿度接近中性的潮濕土壤，且距地表約3～8cm的土壤層取樣。(2)樣品的稀釋測定土壤中細(xì)菌的數(shù)量，一般選用1×104、1×105和1×106倍稀釋的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，當(dāng)?shù)谝淮巫鲞@個實驗時可以將稀釋的范圍放寬一點。(3)微生物的培養(yǎng)與觀察細(xì)菌一般在30～37℃的溫度下培養(yǎng)1～2d。每隔24h統(tǒng)計一