定量PCR基本原理及方法

定量PCR基本原理及方法熒光定量PCR基本原理熒光定量PCR標(biāo)記方法熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用內(nèi)容

定量PCR技術(shù)的產(chǎn)生1992年由Higuchi等人第一次報告：使用EB加入PCR反應(yīng)體系，經(jīng)改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測樣品的熒光強(qiáng)度核酸

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染料熒光后來用與雙鏈DNA有更強(qiáng)結(jié)合力的SYBRGreenI取代EB熒光定量PCR基本原理Real-timeChemistriesPCR的理論方程：Y=x×(1+Ev)n

Y：擴(kuò)增物數(shù)量；X：起始模板數(shù)量；Ev：擴(kuò)增效率；n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)1.終點(diǎn)法定量原理前提：在最佳實驗、循環(huán)次數(shù)n一定、Ev相同原理：根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的量計數(shù)反應(yīng)物中原始分子數(shù)，即：lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY-b(b為常數(shù))2.實時檢測法定量原理前提：在最佳實驗、相同Ev以、擴(kuò)增產(chǎn)物量相同原理：反應(yīng)物中原始分子數(shù)（X）與其所需要的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)（n）成反比，由此計算出標(biāo)本中靶分子的準(zhǔn)確含量，即：LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b-n×a(a、b為常數(shù))熒光定量PCR的定量原理閾值：PCR擴(kuò)增信號進(jìn)入相對穩(wěn)定的對數(shù)增長期時的熒光值。閾值（threshold）的設(shè)定PCRefficiency=[10(-1/slope)]-1Whereslope=1/mSlope-3.322100%efficiencyPCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。Ct值——n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)

n:擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的確定logN=logN0+nlogEn=Ct每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品的Ct值，即可計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

Ct值與起始模板的關(guān)系Y軸—Ct值X—起始拷貝數(shù)的對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由系列稀釋的已知濃度的樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的初始模板濃度logN0=-CtlogE+logN絕對定量——未知濃度的樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較內(nèi)摻式染料SYBRGreenI,LCGreen

序列特異性探針Taqman

MolecularBeaconsFRET

引物特異性探針

Amplifluor(Intergen)

LUX熒光定量PCR標(biāo)記方法5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission內(nèi)摻式染料SYBR-GreenI

5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission內(nèi)摻式染料

SYBR-GreenI

RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）RQExcitationXRQQRExcitationEmission分子信標(biāo)（MolecularBeaconProbe）Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（FRETProbe）熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用研究目的標(biāo)記方法定量分析（基因拷貝數(shù)的絕對定量，基因表達(dá)調(diào)控的相對定量）

Sybr-Green(LCGreen),Taqman,MolecularBeacon,etc

研究目的基因型分析（SNP、突變型分析）

Taqman,MolecularBeacon,FRET,LCGreen熔解曲線分析

Sybr-Green,LCGreen,MolecularBeacon,FRET某科研用戶使用Rotor-Gene3000進(jìn)行基因表達(dá)檢測結(jié)果（自備標(biāo)準(zhǔn)品，檢測樣品做復(fù)管）絕對定量某科研用戶使用Rotor-Gene3000進(jìn)行基因表達(dá)相對定量分析，下圖為用??Ct法得出的分析結(jié)果。（自備標(biāo)準(zhǔn)品，檢測樣品做3次重復(fù)復(fù)管）HouseKeeperGeneGeneofInterest相對定量利用溶解曲線進(jìn)行實驗條件的優(yōu)化（RG3000）熔解曲線分析Annealingat60℃Annealingat63℃標(biāo)記方法

Taqman

定量分析，基因型分析

Sybr-Green

定量分析，熔解曲線分析，基因型分析(LCGreen)

MolecularBeacon

定量分析，熔解曲線分析，基因型分析

FRET

定量分析，熔解曲線分析，基因型分析

AmpliflourProbe，LUX

定量分析基因型分析利用擴(kuò)增信號的種類來分型——Taqman根據(jù)熔解曲線的不同來分型——FRET,MolecularBeaconLCGreen雙Taqman探針法檢測野生型和突變型在基因型分析中，可采用兩種不同的Taqman探針（分別針對野生型和突變型)，即一個突變型探針以一種熒光素（Flr）標(biāo)記，而野生型探針則用不同的熒光物（Tet）標(biāo)記。如果只有一種信號被擴(kuò)增出來，則樣本為對應(yīng)的基因型（野生型或突變型）的純合子；如二者都被有效地擴(kuò)增出來，則樣本為雜合型。利用擴(kuò)增信號的種類來分型雜合型野生型突變型

FRET探針進(jìn)行熔解曲線分析確定基因型FRET探針與模板結(jié)合時，因共振能量的傳遞而信號增強(qiáng)，而當(dāng)在Tm值時，F(xiàn)RET探針與PCR產(chǎn)物分開，熒光信號減弱。通過實時捕捉到的PCR產(chǎn)物在熔解過程中熒光信號的變化，得到PCR產(chǎn)物的熔解曲線。因為發(fā)生基因突變的PCR產(chǎn)物有特定的Tm值，通過測定探針與PCR產(chǎn)物分開時的熔解溫度Tm值，就能確定樣品的基因型。利用熔解曲線檢測基因突變雜合型野生型突變型利用內(nèi)摻式染料進(jìn)行高分辨率熔解曲線（HRM）分析基因型HRM根據(jù)序列長度、GC含量和互補(bǔ)性分析樣品，