實驗3-硝酸還原酶活性測定

實驗三硝酸還原酶活性測定

（p124-127）一、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作二、硝酸還原酶活性測定植物對氮素的吸收和利用以無機(jī)氮為主：硝態(tài)氮（NO3-）和銨態(tài)氮（NH4+）銨態(tài)氮（NH4+）可以直接被植物利用硝態(tài)氮（NO3-）在植物體內(nèi)還原成銨態(tài)氮才能被利用NO3－中的N為高度氧化態(tài)，而細(xì)胞組分中的N均呈高度還原態(tài)，被吸收的NO3-需經(jīng)過還原后才能被利用硝酸鹽的還原由硝酸還原酶(nitratereductase)催化。硝酸鹽的還原硝酸還原酶硝酸還原酶存在于細(xì)胞液中，為一種底物誘導(dǎo)酶。誘導(dǎo)酶(inducedenzyme)

植物體本來不含有，但在特定的外來物質(zhì)(如底物)的影響下誘導(dǎo)形成的酶NO3-誘導(dǎo)的大麥根系和地上部分硝酸還原酶活性變化NO3－的還原在根或葉中均可進(jìn)行NO3－供應(yīng)少時，主要在根中還原NO3－供應(yīng)量大而根中還原力不足時，NO3－運(yùn)到葉片進(jìn)行還原亞硝酸鹽還原為氨亞硝酸還原或在根中的前質(zhì)體，或在葉中的葉綠體中進(jìn)行。還原所需的電子來自還原態(tài)的鐵氧還蛋白。亞硝酸還原酶的輔基由一個鐵硫原子簇和一個西羅血紅素組成NO3-還原為NO2-后，NO2-被迅速運(yùn)進(jìn)質(zhì)體即根中的前質(zhì)體或葉中的葉綠體，并進(jìn)一步被亞硝酸還原酶（NiR）還原為NH3或NH4+。葉綠體葉綠體中，還原反應(yīng)所需的一對電子由還原態(tài)鐵氧還蛋白提供亞硝酸還原酶（NiR）亞硝酸還原酶（NiR）在細(xì)胞液里合成，運(yùn)進(jìn)質(zhì)體時被加工NiR也可被NO3－誘導(dǎo)產(chǎn)生亞硝酸還原受光促進(jìn)（照光植物生成還原態(tài)鐵氧還蛋白）植物缺鐵，亞硝酸還原受阻（鐵氧還蛋白）1.實驗?zāi)康?）理解硝酸還原酶的特性；

2）掌握硝酸還原酶活性測定方法。2.實驗原理1）NR是誘導(dǎo)酶

在取樣前一天外施50mMKNO3或NaNO3溶液、光照培養(yǎng)幼苗，誘導(dǎo)硝酸還原酶的產(chǎn)生。2）NO2-產(chǎn)生NO3-

+NADH+H+NO2-

+NAD++H2O測定反應(yīng)溶液中NO2-含量的增加，即表現(xiàn)NR活性的大小。

NR3）NO2-含量測定—磺胺比色法。NO2-與磺胺在酸性溶液中NO2-形成重氮鹽，再與α-萘胺偶聯(lián)形成紫紅色的偶氮染料，可以用分光光度計測定OD540。當(dāng)磺胺與α-萘胺均過量時，所生成的紅色深淺與NO2-含量成直線關(guān)系。NO2-含量標(biāo)準(zhǔn)曲線：[NO2-]（μmol/ml）=0.0026＋0.359OD540

4）硝酸還原酶活性計算方法NR酶活性（μmolNO2-/h?gfw）[NO2-]×5ml/1ml×10ml（鮮重g×0.5h）=3.材料與方法1）植物材料兩種處理的小麥幼苗水（ck）KNO3（20000Lux，24hr，記作N）2）儀器設(shè)備分光光度計；天平；恒溫水浴鍋；真空抽氣泵；剪刀；移液管；吸耳球；溫箱；渦旋儀3）試劑A液：磷酸緩沖液：水：DNP溶液：蔗糖溶液＝5：5：1：1B液：磷酸緩沖液：KNO3：DNP溶液：蔗糖溶液＝5：5：1：1磺胺試劑α-萘胺試劑4.實驗步驟1）水(ck)和KNO3（N）處理的小麥葉片各取2份（新鮮葉片中段），用蒸餾水洗凈、搽干，剪成1cm小段，每份稱取0.3克；將4份（ck、N）葉段分別置于含有10mlA、B（KNO3）溶液的兩只試管中，即ckA、ckB、NA和NB四管；2）將四只試管放在真空干燥器中抽氣30分鐘，放氣后搖晃直至葉段沉于溶液中；兩種處理的小麥幼苗葉片中段各取0.3g水(ck)KNO3（N）10mlA液B液A液B液抽氣30分鐘25～30℃溫箱中黑暗保溫30分鐘取1ml反應(yīng)液+2ml磺胺試劑+2mlα-萘胺試劑混勻注意加液順序25℃溫箱反應(yīng)5分鐘取出后桌面靜置15分鐘540nm測定樣品的吸光值取A液或B液1ml代替反應(yīng)液作為對照管放氣后搖晃直至葉段沉于溶液中3）將4只試管置于25～30℃溫箱中黑暗保溫30分鐘；4）立即分別吸取1ml反應(yīng)液，各加入2ml磺胺試劑，搖勻，再加2mlα-萘胺試劑（注意順序），用漩渦儀混合搖勻，25℃溫浴反應(yīng)10分鐘,取出后桌面靜置15分鐘；5）取A液或B液1ml代替反應(yīng)液，加入2ml磺胺試劑和2mlα-萘胺試劑，作為對照管，在540nm測定樣品的吸光值。表1硝酸還原酶的活性處理H2O（ck）

KNO3（N）

A液B液A液B液吸光度ODB-ODA[NO2-](unit)

NR活性(unit)

[NO2-]（μmol/ml）=0.0026＋0.359OD5405.實驗結(jié)果記錄注意事項1）搖晃直至葉段沉于溶液中2）磺胺試劑和α-萘胺試劑（加入時注意順序）3）加入磺胺和α-萘胺后要混合搖勻，靜置30分鐘4）分光光