PCR技術(shù)及其應(yīng)用

DNA的電泳及PCR分析實(shí)驗(yàn)二孔忠新2010.12.06實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)并掌握DNA的電泳原理與技術(shù)學(xué)習(xí)并通過操作掌握基于DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）基本技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳凝膠的EB染色EB使用時(shí)的配制、貯存及使用EB常用水配制成10mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5μg/ml。聚合酶鏈反應(yīng)PolymeraseChainReaction,PCR“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”?！狵orana于1971年1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件：

模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。PCR技術(shù)是生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。PCR技術(shù)基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。變性--退火--延伸變性：加熱至93℃左右一定時(shí)間后，模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備退火(復(fù)性)：模板DNA變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合延伸：模板-引物結(jié)合物在Taq聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)鏈，這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。圖PCR擴(kuò)增DNA原理示意圖①變性（95℃）；②退火；③延伸（72℃）PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系DNA模板

0.1～2ug

引物

10～100pmol

反應(yīng)緩沖液

10uldNTP各200umol/L

耐熱聚合酶

2.5u

Mg2+1.5mmol/L

ddH2O加至100ul引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。設(shè)計(jì)引物1.引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。2.引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。3.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。4.避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。5.引物3’端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。6.引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處。7.引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中量的問題引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。模板的量與純化程度：是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。酶及其濃度：催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))。dNTP的質(zhì)量與濃度：等摩爾配制，遏制錯(cuò)配率，與Mg2＋的濃度比例。Mg2+濃度：濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。PCR反應(yīng)條件溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)溫度與時(shí)間的設(shè)置基于PCR原理三步驟設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。三溫度點(diǎn)法：90～95℃變性再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。二溫度點(diǎn)法對于較短靶基因(長度為100～300bp時(shí))，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性)。溫度與時(shí)間的設(shè)置變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，溫度不能過高，高溫環(huán)境對酶的活性有影響。退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過公式選擇：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60s，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。延伸溫度：一般在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸時(shí)間：可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min足夠。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長些。循環(huán)次數(shù)：決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。溫度與時(shí)間的設(shè)置PCR反應(yīng)的變異反向PCR(reverse

PCR)RACENestedPCR（巢式PCR）半定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR原位PCR……用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段。反向PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR(reverse

PCR)適用于T-DNA、轉(zhuǎn)座子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點(diǎn)分析等研究。不足：限制酶、PCR產(chǎn)物的特異性NestedPCR（巢式PCR）巢式PCR是一種變異PCR，使用兩對PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片斷短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR反應(yīng)：巢式PCR通過兩輪PCR反應(yīng)，使用兩套引物擴(kuò)增特異性的DNA片斷。第二對引物的功能是特異性的擴(kuò)增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片斷。巢式PCR的優(yōu)點(diǎn)，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。

圖

巢式PCR的實(shí)驗(yàn)流程RT-PCRRT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，是一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。對表達(dá)信息進(jìn)行檢測或定量檢測基因表達(dá)差異克隆cDNA（不必構(gòu)建cDNA文庫）RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。?RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用反轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行。RT-PCR一步法或兩步法的形式熒光定量PCR基本原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光試劑，利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)檢測PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠?qū)Ｒ?、靈敏、快速、高重復(fù)性地精確定量起始模板濃度。初始模板濃度定量初始DNA量越多,熒光達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少。Log濃度與循數(shù)呈關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量。本實(shí)驗(yàn)中PCR反應(yīng)體