蛋白質(zhì)濃度測定方法研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)濃度測定方法目錄1經(jīng)典方法2新的方法3測定方法的選擇前言難點(diǎn)背景蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其他生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容是臨床診斷疾病及檢查健康情況的重要指標(biāo)也是很多生物制品、藥物、食品質(zhì)量檢測的重要指標(biāo)意義這些分析方法需要一個(gè)合適的標(biāo)準(zhǔn)蛋白或者其組成氨基酸的序列信息以便準(zhǔn)確估計(jì)目的蛋白濃度在蛋白質(zhì)分離純化過程中，測定蛋白質(zhì)的濃度是一個(gè)很重要的環(huán)節(jié)，可以幫助人們計(jì)算產(chǎn)率、進(jìn)行物質(zhì)平衡或測定靶蛋白的特定活力/效力。缺少這一技術(shù)的輔助，我么就無法明確得知某種蛋白質(zhì)的存在，也就無法完成分離提純的最終目的。1經(jīng)典方法1.1凱式定氮法[原理]絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的氮元素含量相當(dāng)接近，一般恒定在15～17%，平均值為16%左右。只要測定出生物樣品中的含氮量，再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)換算系數(shù)（均值為6.25、乳制品為6.38），就可以計(jì)算出樣品中的蛋白質(zhì)含量。CuSO4作催化劑；K2SO4提高溶液的沸點(diǎn)消化好的樣品在凱氏定氮儀內(nèi)經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨蒸汽將氨蒸至定量硼酸溶液中用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行滴定，記錄，計(jì)算出樣品含氮量高溫條件下強(qiáng)酸(濃H2SO4)把樣品中的蛋白質(zhì)的有機(jī)氮全部消化為無機(jī)氮形式1.1凱氏定氮法——結(jié)果計(jì)算只含蛋白質(zhì)若測定的樣品含氮部分只是蛋白質(zhì)：樣品中蛋白質(zhì)含量（%）=總氮量×6.25若樣品中尚含有其他含氮物質(zhì)，則需加入三氯乙酸，然后測定未加三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸后樣品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及總氮量，從而計(jì)算出蛋白氮，再進(jìn)一步算出蛋白質(zhì)含量：蛋白氮=總氮-非蛋白氮蛋白質(zhì)含量（%）=蛋白氮×6.25含氮雜質(zhì)1.1凱氏定氮法——三鹿奶粉事件化學(xué)式：C3N6H6分子量：126含氮量：66.6%鮮牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，理論上就能提高0.625%蛋白質(zhì)三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，沒有什么氣味和味道，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)，但是尿素等卻有氣味，參入會(huì)容易被檢測出來牛奶和奶粉添加三聚氰胺，就是因?yàn)樗苊俺涞鞍踪|(zhì)三聚氰胺1.2雙縮脲法(Biuret法)[原理]雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物雙縮脲凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。1.2雙縮脲法——操作步驟繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測定待測溶液A540對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無關(guān)。測定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)。試劑(ml)\管號(hào)空白管12345測定管蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（10g/L）-0.10.20.30.40.5-生理鹽水0.50.40.30.20.1-0.4待測樣品------0.1雙縮脲試劑3.03.03.03.03.03.03.0相當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)（g/L）01020304050

1.3紫外吸收法[原理]蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。1.3四種紫外吸收法

280nm的光吸收法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測定待測溶液A280對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度

280nm和260nm的吸收差法核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260≈1.8純核酸的光吸收比值：A280/A260≈0.5對(duì)于含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度：

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×A280－0.74×A260

215nm與225nm的吸收差法蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測定時(shí)，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。肽鍵測定法蛋白質(zhì)溶液在238nm處的光吸收的強(qiáng)弱，與肽鍵的多少成正比。進(jìn)行蛋白質(zhì)溶液的柱層析分離時(shí)，洗脫液也可以用238nm檢測蛋白質(zhì)的峰位。1.4Folin-酚試劑法[原理]又叫Lowry法。這種蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。這種方法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin-酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。Pr.+Cu2+Cu-ProteinBlueProductOH-磷鉬酸磷鎢酸在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物Folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）1.4Folin-酚試劑法——操作步驟試劑（ml）\管號(hào)O12345測定管標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（250μg/ml）—0.20.40.60.81.0—待測溶液——————1.00.9%NaCl1.00.80.60.40.2——堿性銅試劑5.05.05.05.05.05.05.0混勻，室溫放置20min酚試劑0.50.50.50.50.50.50.5721分光光度計(jì)，波長750nm，記錄吸光度值進(jìn)行測定時(shí)，加酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線四種經(jīng)典方法的比較方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說明凱氏定氮法靈敏度低，適用于0.2-1.0mg氮，誤差為±2%費(fèi)時(shí)。8-10h將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定。非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離。用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測定；干擾少，費(fèi)時(shí)太長。雙縮脲法靈敏度低，1-20mg。中速。20-30min多肽鍵＋堿性Cu2+→紫色絡(luò)合物。硫酸銨：Tris緩沖液；某些氨基酸。用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似。紫外吸收法較為靈敏，50-100mg?？焖佟?-10min蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收。各種嘌呤和嘧啶；各種核苷酸。用于層析柱流出液的檢測；核酸的吸收可以校正。Folin-酚試劑法靈敏度高，~5mg。中速。40-60min堿性下肽鍵與Cu2+生成復(fù)合物，還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑生成藍(lán)色化合物，在750nm處光吸收峰。酚類，硫酸銨，Tris緩沖液，甘氨酸，甘油，糖類，檸檬酸。應(yīng)用最廣泛，耗時(shí)較長，需精準(zhǔn)把握時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線不是嚴(yán)格直線形式，干擾物質(zhì)較多，專一性差。2新的方法2.1考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）[原理]考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。2.1考馬斯亮藍(lán)法2.2BCA比色法[原理]堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑（4，4’-二羧酸-2，2’-二喹啉鈉）形成紫顏色的絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測蛋白的濃度。2.2BCA比色法——操作步驟這種方法的突出優(yōu)點(diǎn)是：1.準(zhǔn)確靈敏：BCA試劑的蛋白質(zhì)測定范圍是20-2000μg/ml；MicroBCA試劑測定范圍是0.5-20μg/ml。2.快速：45分鐘內(nèi)完成測定，比經(jīng)典的Lowry法快4倍而且更加方便。3.經(jīng)濟(jì)實(shí)用：除試管外，測定可在微孔板中進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響。4.檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)小于考馬斯亮藍(lán)?；旌螧CA工作試劑（試劑A：試劑B=50：1）充分混合（0.1mL樣品+工作試劑）溫育：37℃,30min.然后冷卻分光光度計(jì)562nm讀吸光度2.3熒光淬滅法[原理]采用熒光法測定蛋白質(zhì)含量，當(dāng)溶液中含有表面活性劑時(shí)，熒光染料分子之間通過疏水相互作用形成二聚體或多聚體，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，加入蛋白質(zhì)溶液導(dǎo)致多聚體解聚而使熒光強(qiáng)度增加，隨著蛋白質(zhì)溶液濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸降低。熒光淬滅原因：這可能是由于表面活性劑存在下蛋白質(zhì)聚集成超分子結(jié)構(gòu)時(shí)包裹了FITC導(dǎo)致FITC熒光被淬滅,從而表現(xiàn)出隨著蛋白質(zhì)溶液濃度增加而出現(xiàn)熒光強(qiáng)度下降的現(xiàn)象。2.3熒光淬滅法——操作步驟在酶標(biāo)板每孔中加入50μL稀釋后的FITC(異硫氰基熒光素)緩沖溶液，再分別加入50μL濃度為10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL的BSA(牛血清白蛋白)溶液，混合均勻后靜置5min再進(jìn)行測定，每個(gè)濃度水平平行分析3次取平均值。儀器參數(shù)設(shè)定如下:振蕩30s，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm，每孔取25次讀數(shù)的平均值，積分時(shí)間20μs，測定溫度37.0℃。3測定方法的選擇第一章

吉滿杯的簡單介紹可檢測范圍內(nèi)的樣品體積可達(dá)到最好的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍，尤其是對(duì)于熒光分析法。膜蛋白或容易聚合的蛋白質(zhì)經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生溶解問題，使得最后測定達(dá)不到預(yù)期的結(jié)果。共價(jià)修飾蛋白，比如糖基化和PEG化的蛋白會(huì)干擾某些方法的測定。如果要同時(shí)測定多個(gè)樣品，選擇微孔板分析可以一次性完成，更加高效。如果樣品量是很有限，選擇非破壞性的方法，比如紫外吸收法可能更合適。開始：蛋白樣品蛋白溶液不含有干擾性物質(zhì)所有方法均可選擇BSA、IgG做標(biāo)準(zhǔn)蛋白，避免使用Bradford法、aminederivatization法避免使用Bradford法、Lowry法避免UVAbs280nm、Bradford法硫醇或還原性試劑存在e.g.DTT避免BCA法、Lowry法螯合劑存在，e.g.EDTA避免BCA法、Lowry法洗滌劑存在，e.g.用于蛋白溶解檢查洗滌劑兼容性數(shù)據(jù)用于沉淀的高濃度鹽、酸存在檢查BCA、LowryBradford兼容性數(shù)據(jù)溶液中有胺或銨離子避免BCA、Lowry、aminederivatization法有合適的參考標(biāo)準(zhǔn)蛋白游離蛋白而非翻譯后修飾蛋白（糖基化）蛋白MW>8kDa含有多個(gè)Tyr/Trp否否否否是是是是是是是是是干擾性物質(zhì)的兼容濃度Conclusion2ndpriorityinitiatives12345EvaluatewhetherofferDTstoremoremarginispossibleTogetherwithotherstrongbrands,communicate“