GB/T 18936-2003高致病性禽流感診斷技術

ICS11.220B41中華人民共和國國家標準GB/T18936—2003高致病性禽流感診斷技術Diagnostictechniquesforhighlypathogenicavianinfiuenza2003-01-10發(fā)布2003-05-01實施華中和八發(fā)布國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局

GB/T18936—2003前高致病性禽流感（highlypathogenicavianinfluenza,簡稱HPAI)是由正黏病毒科流感病毒屬中的A型流感病毒引起的，被世界動物衛(wèi)生組織WorldOrganizationforAnimalHealth（英）.OfficeInternationaldesEpizooties（法）,OIEJ列為A類疾病,我國將其列為一類動物疫病。本標準是參考（IE《診斷試驗和疫苗標準手冊》2000年版).并結合我國現(xiàn)有動物衛(wèi)生法規(guī)及農業(yè)部對禽流感的相關政策和措施制定的。本標準的附錄B、附錄（、附錄D、附錄E、附錄F為規(guī)范性附錄，附錄A為資料性附錄本標準由中華人民共和國農業(yè)部提出。本標準由全國動物檢疫標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所本標準起草人：唐秀英、李海燕、田國斌。

GB/T18936-2003高致病性禽流感診斷技術范圍本標準規(guī)定了高致病性禽流感(HPAI)病毒分離與鑒定技術、血凝(HA)和血凝抑制（HI)試驗、瓊脂凝膠免疫擴散（AGID)試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(間接ELISA)的技術要求。本標準所規(guī)定的高致病性禽流感病毒分離與鑒定技術適用于各種禽類高致病性禽流感的病原分離和鑒定：AGID和間接ELISA適用于A型禽流感病毒的型特異性檢驗：HA-HI試驗適用于禽流感病毒的血凝素亞型鑒定2病毒分離和鑒定技術21材料準備2.1.1病料的采集：死禽采集氣管、牌、肺、肝、腎和腦等組織樣品·進行分別處理或者同時處理;活禽病料應包括氣管或泄殖腔執(zhí)子.尤其是以采集氣管執(zhí)子更好;小珍禽用執(zhí)子取樣易造成損傷，可采集新鮮類便。2.1.2病料的保存：病料應放在含有抗菌素的pH值7.0～7.4的等滲磷酸鹽緩沖液（PBS)內(無PBS可用25%～50%的甘油鹽水)?？股氐倪x擇視當?shù)厍闆r而定，組織和氣管拔子懸液中應含有青霉素(2000IU/mL.)、鏈霉素(2mg/mL）、慶大霉素(50g/mL)和制霉菌素(1000IU/mL.)，但糞便和泄殖腔執(zhí)子所有的抗生素濃度應提高5倍.加人抗生素后pH值應調至7.0～7.4。在室溫放置1h～2h后樣品應盡快處理,沒有條件的可在4℃存放幾天,也可于低溫條件下保存（—70℃購存最好)。2.1.3病料的處理：將棉斌子充分搶動、檸干后棄去技子;糞便、研碎的組織用含抗生素的pH值7.0～7.4的等滲PBS溶液配成10%～20%（g/mL)的懸液。樣品液經(jīng)1000r/min離心10min.取上清液作為接種材料。2.2病毒分離2.2.1樣品接種：取處理好的樣品,以0.2mL/胚的量經(jīng)尿囊腔途徑接種9日齡～11日齡SPF雞胚·每個樣品接種5個胚，于35C～37℃孵化箱內孵育.18h后每8h觀察雞胚死亡情況。2.2.2病毒收獲：無菌收取18h以后的死胚及96h仍存活雞胚的雞胚尿囊液,測血凝活性,陽性反應說明可能有正黏病毒科的流感病毒;若無血凝活性或血凝價很低，則用尿囊液繼續(xù)傳2代，若仍陰性.則認為病毒分離陰性。2.3病毒鑒定2.3.1A型流感病毒的型特異性鑒定：樣品接種雞胚后，若雞胚尿囊液具有血凝活性，可用具有血凝活性雞胚的絨毛尿囊膜(CAM)制成抗原,與A型禽流感病毒標準陽性血清進行AGID試驗,檢測樣品中是否含有A型流感病毒。2.3.1.1抗原制備：從縣有血凝活性的雞豚中取出絨手尿囊膜,用pH7.2的PBS沖洗后.將CAM用研磨器磨碎。磨碎的抗原反復凍融3次～4次;以1000r/min離心10min后取上清,按終濃度為0.1%的量加入甲醛溶液。置37C溫箱滅活36h做滅活檢驗后即可作為AGID試驗用抗原,用禽流感標準陽性血清進行型特異性鑒定，若被檢樣品與標準陽性血清之間出現(xiàn)清晰的沉淀線即可判定樣品中含有A型禽流感病毒2.3.1.2AGID試驗方法：按本標準第4章中的方法進行