備課素材：凝膠電泳實驗問題釋疑-高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

凝膠電泳實驗問題釋疑2019版人教高中生物學(xué)選擇性必修3新增了DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定的內(nèi)容。但教材受篇幅所限，只對凝膠電泳的原理和過程進(jìn)行了簡略的介紹，對某些具體問題并未進(jìn)行深人闡釋。凝膠電泳實驗需要用到電泳儀、電泳槽等儀器和溴化乙啶（EB）、載樣緩沖液等試劑，目前大部分高中學(xué)校尚且不具備開展該實驗的條件。因此，一些師生對凝膠電泳實驗的原理、常用試劑的作用、凝膠電泳的類型等問題存在疑惑。1．凝膠電泳中DNA分子的移動方向是怎樣的？教材P84提到：DNA分子具有可解離的基團(tuán),在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動。但教材中并未說明凝膠電泳中DNA分子所帶電荷的種類。因此，學(xué)生并不清楚凝膠電泳中DNA分子會向哪種電極移動。DNA有可解離的酸性和堿性基團(tuán)，在溶液中會發(fā)生解離而帶電。溶液的pH不同，DNA帶電情況也不相同。當(dāng)溶液的pH達(dá)到某種物質(zhì)的等電點（plI)時，該物質(zhì)所帶凈電荷為零，呈電中性。一般而言，堿性溶液的pH大于pl,物質(zhì)帶負(fù)電荷，在電場中會向正極移動；而酸性溶液的pH小于pI,物質(zhì)帶正電荷，在電場中會向負(fù)極移動。DNA分子的pl在4~4.5之間，而瓊脂糖凝膠電泳常用緩沖液的pH一般在6~9之間，此時，緩沖溶液的pH大于DNA的pI,DNA帶負(fù)電荷。因此,在凝膠電泳時DNA分子會由負(fù)極向正極移動。在實驗過程中，需要注意凝膠放置的方向，應(yīng)該把帶有加樣孔的一端靠近電泳槽的負(fù)極，以便DNA分子從加樣孔處向正極移動。2．影響DNA分子遷移速率的因素有哪些？教材P.84提到：在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。那么，這些因素是如何影響遷移速率的呢從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取出來的瓊脂糖是一種常用的電泳介質(zhì)。瓊脂糖是由D-吡喃半乳糖和3,6-脫水-L-吡喃半乳糖交替連接而成的一種線性多聚合物。標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖通常在85~95℃時熔化，經(jīng)冷卻至35~42℃時可以制成凝膠。制成的瓊脂糖凝膠是一種帶孔的篩網(wǎng)狀多聚物。瓊脂糖濃度會影響凝膠篩孔的大小，進(jìn)而影響DNA分子的遷移速率。凝膠濃度越小，篩孔越大，DNA分子遷移速率就越高；凝膠濃度越大，篩孔越小，DNA分子遷移速率就越低。DNA分子的大小也會影響遷移速率。當(dāng)凝膠濃度相同時，較大的DNA分子因體積大，所占據(jù)的空間大，在穿過凝膠孔隙時會遇到較大的阻力，穿過孔隙相對困難，遷移速率低。反之，遷移速率就高。電泳一段時間后，較大的DNA分子遷移距離小，離加樣孔近；而較小的DNA分子遷移距離大，離加樣孔遠(yuǎn)。相同大小的DNA分子則會聚集在凝膠同一特定的位置上。根據(jù)這一特性，可以把不同大小的DNA分子分離開來（圖1)。分子大小相同但構(gòu)象不同的DNA片段，遷移速率也不相同。例如，pUC19質(zhì)粒3種構(gòu)象的遷移速率不盡相同。超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA（cccDNA）有效體積小，穿過凝膠孔隙時遇到的阻力小，遷移速率快。當(dāng)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的兩條鏈斷裂后形成線狀DNA（LDNA）的構(gòu)象，遷移速率較慢；當(dāng)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的1條鏈斷裂時，會形成開環(huán)質(zhì)粒DNA（ocDNA）的構(gòu)象，遷移最慢。除了上述影響因素外，凝膠類型和電場強(qiáng)度等因素也會影響DNA分子的遷移速率。3．常用的核酸染料有哪些？是如何發(fā)揮作用的？DNA分子本身沒有顏色，怎樣才能在電泳結(jié)果中觀察到呢？教材P.85提到：制膠時，稍冷卻后，加人適量的核酸染料混勻。由于DNA分子本身沒有顏色，需要將電泳結(jié)果用核酸染料處理后放在紫外線投射儀等特定儀器下才能觀察到。EB是一種實驗室常用的核酸染料，它是一種扁平分子，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2所示。EB可插人DNA雙鏈相鄰堿基之間（圖3)形成EBDNA復(fù)合物，該復(fù)合物在紫外線激發(fā)下發(fā)射出紅橙色熒光。發(fā)出的熒光一部分來自EB吸收的紫外線能量，另一部分來自核酸吸收后傳給EB的紫外線能量，而且EB結(jié)合在核酸堿基對之間的疏水環(huán)境大大增加了熒光產(chǎn)率。EB-DNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度與DNA含量成正相關(guān)，根據(jù)熒光強(qiáng)度可粗略估計樣品DNA的含量。EB作為核酸染料具有操作簡單的優(yōu)點。EB不與瓊脂糖凝膠結(jié)合，只有DNA分子能吸收EB并發(fā)出熒光，因此無須洗去凝膠中游離的EB，即可檢測DNA條帶。盡管EB具有染色效果好、操作簡單等優(yōu)點，但其是一種致癌物質(zhì)，在實驗操作時一定要戴好手套，避免直接接觸。目前，一些實驗中會使用Goldview等毒性小的新型核酸染料替代EB，其靈敏度與EB相當(dāng)，使用簡便，但價格較高。4．電泳緩沖液的成分是什么？電泳緩沖液維持電泳系統(tǒng)pH穩(wěn)定的原理是什么？電泳緩沖液還有其他的作用嗎？電泳時陽極與陰極都會發(fā)生電解反應(yīng)，引起陽極和陰極的pH發(fā)生改變。如何使電泳系統(tǒng)的pH保持相對穩(wěn)定呢？教材P.85提到將電泳緩沖液加人電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。那么，電泳緩沖液的成分是什么？電泳緩沖液維持電泳系統(tǒng)pH穩(wěn)定的原理是什么？電泳緩沖液還有其他的作用嗎？電泳時陽極與陰極都會發(fā)生電解反應(yīng)，陽極發(fā)生氧化反應(yīng)，陰極發(fā)生還原反應(yīng)，長時間的電泳會使陽極變酸、陰極變堿，加人電泳緩沖液可以維持電泳系統(tǒng)pH的相對穩(wěn)定。電泳緩沖液是指在進(jìn)行凝膠電泳時所使用的緩沖溶液，是凝膠電泳系統(tǒng)的一個重要組成。常用的核酸電泳緩沖液有Tris乙酸(TAE)和Tris-硼酸(TBE),這兩種緩沖液都含有Tris堿和EDTA（乙二胺四乙酸）,主要區(qū)別在于酸的成分不同。兩種緩沖液在電泳中的作用相同，但各有優(yōu)缺點：TAE分辨率高，但緩沖能力弱，不能長時間使用，需要經(jīng)常更換；TBE分辨率略低，但緩沖能力強(qiáng)，可以反復(fù)使用。電泳緩沖液可以使溶液具有一定的導(dǎo)電性，有助于DNA分子的遷移。Mg2+是DNA酶的激活劑，電泳緩沖液中的EDTA是一種螯合劑，能與2+等二價金屬離子結(jié)合，可防止電泳時DNA被降解。5．，凝膠載樣緩沖液是怎樣起指示作用的？它又是如何解決樣品飄散問題的？DNA分子沒有顏色，如何觀測電泳進(jìn)程呢？加樣時，樣本是否會飄散在電泳緩沖液中？教材P.85提到：將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注人凝膠的加樣孔內(nèi)。那么，凝膠載樣緩沖液是怎樣起指示作用的？它又是如何解決樣品飄散問題的呢？凝膠載樣緩沖液是在加樣之前與待電泳的樣本相混合的一種緩沖液。瓊脂糖凝膠電泳用到的載樣緩沖液(DNAloadingbuffer)主要由溴酚藍(lán)、二甲苯青FF、Tris-HCl、甘油或蔗糖等組成。溴酚藍(lán)和二甲苯青FF是兩種在電場中以預(yù)知速率向正極泳動的染料。瓊脂糖凝膠濃度在0.5%~1.4%的范圍內(nèi),以0.5×TBE作電泳液時，溴酚藍(lán)呈現(xiàn)藍(lán)紫色，與長300bp的雙鏈線狀DNA的遷移速度相同，而二甲苯青FF呈現(xiàn)藍(lán)色，與長4kb的雙鏈線狀DNA的遷移速度相同。這兩種指示劑能夠分別顯示300bpDNA和4kbDNA的電泳進(jìn)程，指示終止電泳的時間。在電泳時，當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動到距凝膠前沿1~2cm處，要停止電泳。染料的另一個作用是使樣本呈現(xiàn)顏色，完成加樣的加樣孔呈現(xiàn)藍(lán)色，未加樣的加樣孔為無色，從而使加樣操作更加便利。若樣品密度較小，容易流人附近加樣孔，會造成交叉污染，影響結(jié)果的分析。緩沖液中含有的甘油或蔗糖成分能夠增加樣品密度，保證每個樣品更容易沉入各自的加樣孔，防止飄散進(jìn)人其他加樣孔。6標(biāo)準(zhǔn)參照物是什么？有什么作用？電泳結(jié)束后，如何判斷樣本中是否含有待測DNA分子？如何確定待測DNA分子的大小及含量？教材P.85提到：上樣時會留一個加樣孔加人指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。那么，標(biāo)準(zhǔn)參照物是什么？它如何指示分子大?。窟@些問題教材并未說明。凝膠電泳時用到的標(biāo)準(zhǔn)參照物是DNA標(biāo)記（DNAMarker），它含有若干組堿基對數(shù)目已知且具有一定梯度變化的DNA片段。DNAMarker和樣本DNA同時進(jìn)行凝膠電泳，通過對比兩者的遷移速率，可以大致估計樣本DNA的大小。為了使估計結(jié)果更加準(zhǔn)確，在凝膠電泳時盡量選擇在目標(biāo)片段大小附近梯度較為密集的DNAMarker。借助DNAMarker除了能夠估計樣本DNA的大小之外，還可以通過對比條帶的亮度，粗略估計樣品中DNA的含量。以一份電泳結(jié)果（圖4）為例：該電泳圖顯示的是檢測含有查爾酮合酶基因pMD19-T質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)人大腸桿菌DH5。M對應(yīng)的加樣孔中加人的是DNAMarker，其內(nèi)含有6種分子大小不同的DNA片段，在電泳圖上呈現(xiàn)出6個條帶。1~6加樣孔中加人的是6個菌落的PCR產(chǎn)物。已中動通過，此時大分子DNA之間的遷移速率十知目標(biāo)DNA約為700bp。通過分析可知，6個菌落分接近，難以分離開來。顯然，要分離50kb以上均成功擴(kuò)增出了查爾酮合酶基因片段，目標(biāo)質(zhì)粒成的大分子DNA或染色體DNA，用普通的瓊脂糖凝功轉(zhuǎn)人大腸桿菌。條帶1比條帶6略窄一些，因膠電泳已經(jīng)無法達(dá)到分離目的了。脈沖電場凝膠此，條帶1中DNA含量較少。7．分離DNA和蛋白質(zhì)都可以用瓊脂糖凝膠電泳嗎？為什么有些電泳裝置是水平的，而有一些電泳裝置是垂直的？凝膠電泳有瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和脈沖電場凝膠電泳3種類型。上文中介紹的瓊脂糖凝膠電泳分辨的DNA長度范圍廣，能夠分辨0.2kb~50kb之間的DNA片段，但分辨率低，只能區(qū)分相差100bp以上的DNA分子。瓊脂糖凝膠電泳采用水平方式進(jìn)行電泳。要分辨長度差距較小的DNA片段，需要借助聚丙烯酰胺凝膠電泳，它可以分辨大小只相差1bp的DNA分子,但其分辨的長度范圍比較窄，在1~1000bp之間。聚丙烯酰胺凝膠電泳采用垂直方式進(jìn)行電泳[5]。聚丙烯酰胺凝膠是一種在催化劑作用下由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的人工合成凝膠。聚合時，由單體丙烯酰胺聚合成鏈狀物，由交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺將鏈與鏈交聯(lián)成網(wǎng)狀,形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的不溶于水的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠電泳除了用于分辨DNA以外，還常用于蛋白質(zhì)的分離，如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是最常用的一種分離蛋白質(zhì)的技術(shù)。普通的瓊脂糖凝膠電泳一般不能分離分子大小在50kb以上的DNA分子。因為DNA分子在凝膠介質(zhì)中呈無規(guī)卷曲的構(gòu)象，當(dāng)大分子DNA通過比自身直徑小的凝膠篩孔時，將會改變無規(guī)卷曲的構(gòu)象，沿電場方向拉伸，從凝膠前后相鄰的孔隙泳也是以瓊脂糖作為凝膠介質(zhì)，與普通瓊脂糖凝膠電泳的主要區(qū)別在于通過交替用兩個垂直方向的不均勻電場,DNA分子在凝膠介質(zhì)中的泳動方向會隨電場方向