第14章-維生素的分析

第十四章維生素類藥物的分析概述維生素：是維持人體正常代謝機(jī)能所必需的微量營養(yǎng)物資。人體不能合成維生素。VitA、D2、D3、E、K1等

脂溶性水溶性VitB族(B1、B2、B6、B12)VitC、葉酸、煙酸、泛酸等。分類按溶解度分本章僅對(duì)維生素(A、B1、C、E)進(jìn)行學(xué)習(xí)討論-H維生素A醇-COCH3維生素A醋酸酯-COC15H31維生素A棕櫚酸酯R:第一節(jié)維生素A為一個(gè)具有共軛多烯醇側(cè)鏈的環(huán)己烯（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、

具有UV吸收存在多種立體異構(gòu)化合物天然維生素A主要是反式易發(fā)生脫氫生成去氫維生素A2

易脫水生成去水維生素A3

易聚合反應(yīng)生成無活性維生素A△或有金屬離子存在時(shí)更易氧化共軛多烯側(cè)鏈易被氧化（二）環(huán)氧化物VitA醛VitA酸（三）、與三氯化銻發(fā)生呈色反應(yīng)（四）、溶解性不溶于水易溶于有機(jī)溶劑和植物油等CHCl3三氯化銻反應(yīng)（一）條件無水無醇CHCl3鑒別試驗(yàn)二、藍(lán)色紫紅300-400nm掃描λmax為326nm一個(gè)吸收峰UV法（二）300-400nm掃描384、367、389nm三個(gè)吸收峰去水VitA（VitA3）↓VitABP對(duì)照品法顯色劑三氯化銻TLC法（三）三、含量測定

目前各國藥典均采用紫外分光光度法替代三氯化銻比色法（一）、紫外分光光度法利用維生素A醇和其醋酸酯分子中具多烯共軛體系結(jié)構(gòu)，在325～328nm處有選擇性吸收峰，故可進(jìn)行含量測定。立體異構(gòu)體氧化產(chǎn)物及光照產(chǎn)物合成中間體去氫維生素A（VitA2）去水維生素A（VitA3）均對(duì)測定有干擾，故采用三點(diǎn)校正法1：測定原理，三個(gè)波長的吸收度，公式計(jì)算校正吸收度，再計(jì)算含量。故得名。該法的依據(jù)：①雜質(zhì)的吸收在310~340nm波長范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長的增大吸收度減?。虎谖镔|(zhì)對(duì)光的吸收具有加和性。2波長的選擇：最大吸收波長，及兩側(cè)各選一波長①第一法（等波長差法）1=328nm，

2

=316nm，3=340nm，△=12nmVitA的max（328nm）

Ch.P用于測定維生素A醋酸酯

第二法（等吸收比法）分別在1的兩側(cè)各選一點(diǎn)

A2=A3=6/7A1

1=325nm，2=310nm，3=334nm

Ch.P用于測定維生素A醇

3.雜質(zhì)的吸收對(duì)V.A有影響的雜質(zhì)主要有以下幾種：(1)V.A2和V.A3(2)維生素A的氧化產(chǎn)物(3)維生素A在光照下產(chǎn)生的無活性的聚合物(4)維生素A的異構(gòu)體等。以上這些雜質(zhì)在310nm-340nm的波長范圍內(nèi)有吸收，干擾維生素A的測定。4.測定方法（1）第一法（直接測定法，適用于純度高的維生素A醋酸酯環(huán)己烷溶解）1）方法在300、316、328、340、360nm測吸收度2）計(jì)算a.吸光系數(shù)E1%1cm

b.求效價(jià)（IU/g）：效價(jià)指每g供試品所含維生素的A的國際單位數(shù)。IU/g=c.求維生素A醋酸酯占標(biāo)示量的百分含量

3）換算因子：4）A值的選擇：a.計(jì)算吸收度比值：與中國藥典的吸收度比值相比較，判斷每個(gè)差值的絕對(duì)值是否超過0.02。b.判斷法最大吸收波長在326-329nm之間，且5個(gè)波長下的絕對(duì)值差值均不超過0.02時(shí)，可直接用328nm波長處的測得的吸收度值求得吸收系數(shù)。

最大吸收波長在326-329nm之間，計(jì)算5個(gè)波長下的絕對(duì)差值，如果有一個(gè)或幾個(gè)超過0.02，應(yīng)按以下的方法進(jìn)行判斷：若（A328校正-A328）*100%/A328

所得的數(shù)值在±3.0%，則仍不用校正公式計(jì)算吸收度?？芍苯佑肁328代入E=A/C.L若（A328校正-A328）*100%/A328

所得的數(shù)值在-15.0%到-3.0%，則應(yīng)用A328校正代入E=A/C.L若（A328校正-A328）*100%/A328

所得的數(shù)值在小于-15%或大于+3%，則不能用本法測定，應(yīng)使用第二法。

如果最大吸收波長不在326-329nm之間，也不能用本法測定。采用第二法第一法的校正公式為：

A328校正=3.52（2A328–A316-A340）（2）第二法（皂化法，適用于維生素A醇）1）方法精密稱取一定量的供試品，加KOH乙醇溶液后煮沸回流，得到的皂化液再經(jīng)過提取、洗滌、濾過、濃縮和干燥等處理，最后用異丙醇溶解殘?jiān)⑾♂尦擅?ml中含維生素A為9-15個(gè)國際單位數(shù)的溶液，在300、310、325、334nm波長處測定吸收度，并確定最大吸收波長（應(yīng)為325nm）。2）計(jì)算同第一法。見書p250-2513）A值的選擇如果最大吸收波長在323-327nm之間，且A300/A325比值≤0.73，按下法判斷：a.若（A325校正-A325）*100%/A325

所得的數(shù)值的絕對(duì)值在3%，可直接用A325

代入E=A/C.Lb.若（A325校正-A325）*100%/A325

所得的數(shù)值的絕對(duì)值超過3%，則用應(yīng)用A325校正代入E=A/C.L如果最大吸收波長不在323-327nm之間，或A300/A325比值>0.73，表示供試品中雜質(zhì)含量太高，應(yīng)采用色譜法將未皂化部分純化再進(jìn)行測定。

第二法的校正公式：A325校正=6.815A325–2.555A310-4.260A3346.討論1）.吸收度校正方法：維生素A醋酸酯：直線方程法（代數(shù)法）維生素A醇：相似三角形法（幾何法或6/7定位法）2）.在應(yīng)用三點(diǎn)校正法時(shí)，除其中一點(diǎn)是在最大

吸收波長處測定外，其余兩點(diǎn)均在最大吸收峰的兩側(cè)進(jìn)行測定。如果儀器波長精度不準(zhǔn)確時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較大誤差。因此，在測定之前務(wù)必要校正波長，并可用全反式維生素A進(jìn)行測定，比較測定結(jié)果和比值是否與對(duì)照品相符合，以進(jìn)一步核對(duì)波長是否準(zhǔn)確。測定的樣品不得少于兩份。7.應(yīng)用示例維生素A膠丸、維生素AD膠丸和維生素AD滴劑等均可采用本法測定。第一法第二法測定對(duì)象維生素A醋酸酯維生素A醇方法直接取樣，測定皂化提取，測定溶劑環(huán)己烷異丙醇max

328nm325nm測定波長5個(gè)4個(gè)換算因數(shù)19001830第一法與第二法的區(qū)別三氯化銻比色法（二）優(yōu)點(diǎn)簡便快速λmax618nm～620nm標(biāo)準(zhǔn)曲線法缺點(diǎn)呈色不穩(wěn)定（5~10s內(nèi)）水分干擾與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差≤1℃專屬性差三氯化銻有腐蝕性（二）藍(lán)色+3SbClVitA（三）高效液相色譜法RP-HPLC同時(shí)測定人血清中VitA和VitE的含量1、儀器與分析條件：HPLC-UV、C18(300×3.9mm）、甲醇－水（96：4）、流速：1.2ml/min、檢測波長：0～8min(330nm),8min后(292nm）內(nèi)標(biāo)：維生素A醋酸酯維生素B1廣泛分布于米糠、麥麩和酵母中，具有維持糖代謝及神經(jīng)傳導(dǎo)與消化的正常功能。主要用于治療維生素B1缺乏癥、多發(fā)性神經(jīng)炎及胃腸疾病。第二節(jié)維生素B1氨基嘧啶環(huán)－CH2－噻唑環(huán)(季銨堿)HClCl-嘧啶環(huán)的氨基、噻唑環(huán)的季銨

為兩個(gè)堿性集團(tuán)

（一）溶解性1、易溶于水，乙醇微溶，乙醚不溶2、水溶液呈酸性（二）UV共軛雙鍵λmax=246nm結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、（三）硫色素反應(yīng)與生物堿沉淀劑（碘化汞鉀等）↓（四）生物堿沉淀反應(yīng)嘧啶環(huán)——噻唑環(huán)——（五）氯化物特性本品為鹽酸鹽，呈氯化物的反應(yīng)。ChP鑒別試驗(yàn)二、（一）硫色素反應(yīng)硫色素＋2HVitB1H+H+H+H+（二）沉淀反應(yīng)（三）氯化物反應(yīng)（五）紅外分光光度法（四）硫元素反應(yīng)三、含量測定喹那啶紅－亞甲藍(lán)（紫紅→天藍(lán)）（一）非水溶液滴定法反應(yīng)摩爾比為1：2UV法（二）片劑、注射劑=421（每片）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=A=ECL規(guī)格g/片g/100mlgChPWEA%cmD10011××%100標(biāo)示量平均片重××（三）硫色素?zé)晒夥ㄔ?、熒光硫色素異丁醇鐵氰化鉀1VitBNaOH通過與對(duì)照品熒光強(qiáng)度的比較即可測得供試品含量2、實(shí)驗(yàn)操作40ml具塞試管3支→對(duì)照品溶液5ml；其中2支加入氧化試劑3.0ml，再迅速加入異丁醇20ml，振搖。第三支試管中加入3.5mol/l的NaOH，同法操作為空白。另取三支試管加入對(duì)照品同法操作。各試管中加入無水乙醇2ml，分取異丁醇，進(jìn)行熒光測定。3、結(jié)果計(jì)算特點(diǎn)4、（1）靈敏度高，線性范圍寬（2）代謝產(chǎn)物不干擾，適用于體液分析（3）該法適用于VitB1的制劑含量分析（4）可用BrCN為氧化劑，反應(yīng)定量完全，適合于生物樣本分析第三節(jié)維生素CL－抗壞血酸具有烯二醇結(jié)構(gòu)；具有內(nèi)酯環(huán)；具2個(gè)手性碳原子具有旋光性1、易溶于水2、水溶液呈酸性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、（一）溶解性烯二醇結(jié)構(gòu)二酮基結(jié)構(gòu)烯二醇結(jié)構(gòu)（二）還原性有活性有活性無活性△糖類的顯色反應(yīng)50℃結(jié)構(gòu)與糖類相似（三）具糖的性質(zhì)C3－OH的pKa=4.17C2－OH的pKa=11.57酸性（四）一元酸L(+)－抗壞血酸活性最強(qiáng)手性C（C4、C5）（五）光學(xué)活性**與堿反應(yīng)（六）水解性弱堿中生成單鈉鹽，強(qiáng)堿中水解七紫外吸收特性與氧化劑的反應(yīng)（一）鑒別試驗(yàn)二、去氫抗壞血酸]O[VitC1、與AgNO3反應(yīng)2、與2，6-二氯靛酚反應(yīng)氧化型玫瑰紅色還原型藍(lán)色OHˉ（玫瑰色）（無色）3.其他氧化劑的反應(yīng)：亞甲藍(lán)或高錳酸鉀試劑褪色

堿性酒石酸銅磚紅色沉淀

磷鉬酸鉬藍(lán)

糖類的反應(yīng)（二）或鹽酸50℃吡咯USP（藍(lán)色）(糠醛)戊糖50℃(吡咯)UV（三）BP0.01mol/LHCl三、雜質(zhì)檢查1.溶液的澄清度與顏色：有色雜質(zhì)分光光度法

2.鐵、銅離子：原子吸收分光光度法指示劑淀粉指示液原理1、碘量法（一）含量測定四、H+取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液顯藍(lán)色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6方法2、（1）酸性環(huán)境.HAc

（2）新沸冷H2O減慢VitC被O2氧化速度討論3、（3）立即滴定趕走水中O2減少O2的干擾（4）附加劑干擾的排除片劑——滑石粉——過濾注射劑——抗氧劑——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O52，6-二氯靛酚鈉滴定法法（二）USPJP原理1、酚亞胺二氯靛酚，-62VitC自身指示終點(diǎn)法方法2、（2）快速滴定2min內(nèi)

（1）酸性環(huán)境HPO3-HAc

穩(wěn)定VitC防止其他還原性物質(zhì)干擾（3）剩余比色測定

（定量過量）（測剩余染料）討論3、（4）缺點(diǎn)

需經(jīng)常標(biāo)定貯存≤一周不穩(wěn)定干擾多

氧化力較強(qiáng)三、高效液相色譜法人血漿中VitC濃度的HPLC法測定1、色譜條件2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備3、血漿樣品的處理：酸性溶液沉淀蛋白法4、方法學(xué)考察5、測定苯并－二氫吡喃醇VitE為二氫吡喃醇衍生物第五節(jié)維生素E

名稱R1R2相對(duì)活性α-生育酚β-生育酚γ-生育酚δ-生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1***VE為α-生育酚及其各種酯類dl－α－生育酚醋酸酯結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、苯環(huán)+二氫吡喃環(huán)+飽和烴鏈1、溶解性易溶于乙醇、丙酮、乙醚等，水中不溶2、氧化性對(duì)氧十分敏感遇光、空氣可被氧化為生育醌和生育酚二聚體3、UV－284nm吸收系數(shù)為41.0-45.04、乙酰化的酚羥基易水解]O[醌型化合物△生育酚-+orOHHVitE雜質(zhì)，需檢查]O[生育紅（一）硝酸反應(yīng)橙紅色鑒別二、75℃水解HNO3VitE生育酚（橙紅色）生育紅生育酚HNO3強(qiáng)氧化劑三氯化鐵-聯(lián)吡啶反應(yīng)（二）生育酚對(duì)-生育醌[O]弱氧化劑血紅色

=41.0～45.5λmax=284nmλmin=254nm0.01%無水乙醇中UV法（三）薄層板硅膠G展開劑環(huán)己烷-乙醚（4：1）顯色劑硫酸（105℃5′）

VitERf

=0.7-生育酚Rf

=0.5-生育醌Rf

=0.9TLC法（四）2.游離生育酚

雜質(zhì)檢查

三、原理:利用游離生育酚的還原性，可被硫酸鈰定量氧化根據(jù)消耗硫酸鈰滴定液的體積來控制游離生育酚的限量。酸度

以NaOH滴定液（0.1mol/L≤0.5ml）體積控制。（M生育酚=430.8）例

取本品0.10g，加無水乙醇5ml溶解后，加二苯胺試液1滴，用硫酸鈰液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）不得過1.0ml?！?.15％限量四、含量測定GC法（法定方法）（一）GC特點(diǎn)1、選擇性好靈敏度高速度快分離效能好揮發(fā)性低、不穩(wěn)定、極性強(qiáng)→衍生化易受樣品蒸氣壓限制載氣→N2固定液→硅酮（OV-17）擔(dān)體→硅藻土或高分子多孔小球柱溫→265℃檢測器→氫火焰離子化檢測器(FID)內(nèi)標(biāo)→正三十二烷n≥500R≥2VitE測定的色譜條件2、內(nèi)標(biāo)法加校正因子內(nèi)標(biāo)法供試液（樣品+內(nèi)標(biāo)）內(nèi)標(biāo)物對(duì)照液（對(duì)照+內(nèi)標(biāo)）是樣品中不存在的物質(zhì)與被測組分峰靠近能與各組分完全分離與被測組分的量接近WWKK%VitE%10012=稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)樣對(duì)實(shí)際工作中的計(jì)算方法××××

公元前3500年-古埃及人發(fā)現(xiàn)能防治夜盲癥的物質(zhì)，也就是后來的維A。

1600年-醫(yī)生鼓勵(lì)以多吃動(dòng)物肝臟來治夜盲癥。

1747年-蘇格蘭醫(yī)生林德發(fā)現(xiàn)檸檬能治壞血病，也就是后來的維C。

1831年-胡蘿卜素被發(fā)現(xiàn)。

1905年-甲狀腺腫大被碘治愈。

1911年-波蘭化學(xué)家豐克為維生素命名。

1915年-科學(xué)家認(rèn)為糙皮病是由于缺乏某種維生素而造成的1916年-維生素B被分離出來。

1917年-英國醫(yī)生發(fā)現(xiàn)魚肝油可治愈佝僂病，隨后斷定這種病是缺乏維D引起的。

維生素發(fā)展史1920年-發(fā)現(xiàn)人體可將胡蘿卜轉(zhuǎn)化為維生素A。

1922年-維E被發(fā)現(xiàn)。

1928年-科學(xué)家發(fā)現(xiàn)維B至少有兩種類型。

1933年-維E首次用于治療。

1948年-大劑量維C用于治療炎癥。

1949年-維B3與維C用于治療精神分裂癥。

1954年-自由基與人體老化的關(guān)系被揭開。

1957年-Q10多酶被發(fā)現(xiàn)。

1969年-體內(nèi)超級(jí)抗氧化酶被發(fā)現(xiàn)。

1970年-維C被用于治療感冒。

1993年-哈佛大學(xué)發(fā)表維生素E與心臟病關(guān)系的研究結(jié)果。返回練習(xí)與思考[A型題]1.維生素B1的鑒別方法是A.三氯化鐵反應(yīng)B.硫色素反應(yīng)C.柯柏反應(yīng)D.與堿性酒石酸銅試液反應(yīng)E.雙縮脲反應(yīng)2.維生素E《中國藥典》規(guī)定的含量測定方法為A.非水溶液滴定法B.旋光法C.HPLC法D.紫外分光法E.GC法[B型題]A。亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)B.硫色素反應(yīng)C.硝酸反應(yīng)D.三氯化銻反應(yīng)E.硝酸銀試液的反應(yīng)1.維生素C2.維生素E3.維生素B14.維生素AECBD[X型題]1.用碘量法測定的藥物有A.醋酸地塞米松B.丙酸睪酮C.維生素CD.硫酸阿托品E.維生素C注射液返回2.可用紫外分光光度法測定含量的藥物有A.維生素A丸劑B.丙酸睪酮C.維生素AD.硫酸阿托品E.維生素B1片簡答題簡述碘量法測維生素C含量的原理及實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)。第四節(jié)維生素D維生素D2－骨化醇一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)維生素D3－膽骨化醇開環(huán)的甾體：具有甾類化合物的顯色反應(yīng)，可用于鑒別。手性碳原子：具有旋光性，可用于鑒別。

多烯：可進(jìn)行紫外檢測。

性質(zhì)：1、脂溶性2、不穩(wěn)定性3、旋光性4、顯色反應(yīng)5、紫外吸收特性二、鑒別試驗(yàn)1.顯色反應(yīng)醋酐-硫酸反應(yīng)D2黃紅紫綠D3黃紅紫、藍(lán)綠綠三氯化銻反應(yīng)橙紅色漸變粉紅三氯化鐵反應(yīng)橙黃色二氯丙醇和乙酰氯反應(yīng)綠色2.比旋度鑒別維生素D2維生素D3溶劑

濃度比旋度值