第五講豬口蹄疫診斷與防疫1

第五講豬口蹄疫診斷與防疫一、概況

Foot-and–MouthDisease由口蹄疫病毒引起偶蹄獸的急性、熱性、高度傳染性的動物疫病。OIE規(guī)定為A類傳染病，我國定為動物1類傳染病。曾造成全球流行,17-19世紀(jì),德國、法國、奧地利等有報道，至20世紀(jì)，歐洲仍廣泛流行；亞洲更嚴(yán)重。迄今為止，僅新西蘭未報道口蹄疫。

澳大利亞1872年、日本1933年、美國1929年、加拿大1952年、墨西哥1954年宣布消滅口蹄疫。后采取嚴(yán)格檢疫等防范措施、并因為有良好的天然屏障，未再傳入口蹄疫，屬于長期無口蹄疫國家。

因該病傳播快，加上現(xiàn)代交通發(fā)達(dá)，口蹄疫一直是隱患，隨時有爆發(fā)危險。如1997年臺灣豬口蹄疫，400多萬頭豬被撲殺、銷毀，各種損失達(dá)80億美元。2001年，英國口蹄疫，有2300個點發(fā)病，撲殺牛等450萬頭，直接和間接損失超過90億英鎊。中國：自1990年爆發(fā)以來，我國流行嚴(yán)重。主要是O型，但新疆等牛羊有A型，特別是2004年以來，發(fā)生Asia-1口蹄疫，并傳播至內(nèi)地。中國邊境國家口蹄疫流行亦嚴(yán)重，特別是南亞和西亞國家。二、世界口蹄疫流行新動態(tài)1病毒特性發(fā)生改變，出現(xiàn)優(yōu)勢毒株

口蹄疫7個主型在世界的分布不均勻，其中O型占76%。1999年，世界口蹄疫參考實驗室檢測512份病料（40個國家），49.4%分離到O型病毒。1997年臺灣、2000年韓國及日本、2001年英國均為O型口蹄疫。病毒對宿主易嗜性發(fā)生變化：1997年臺灣口蹄疫豬易感，但牛不出現(xiàn)臨床癥狀2000年韓國口蹄疫僅牛發(fā)病，2002年時僅豬發(fā)病。隱性帶毒對難以防控，可能成為以后新的傳染源O型毒株泛亞株的出現(xiàn)：該毒株具有較強(qiáng)的傳播能力和入侵能力，其宿主有牛、水牛、豬、綿羊、山羊、駱駝、鹿等。1990年在印度首次發(fā)現(xiàn)，1994年傳入沙特，1996年傳入歐洲，1998年在不丹，1999年在臺灣和東南亞，2001年在英國（英國歷史上首次流行泛亞株）。另外，泛亞毒株在不同動物表現(xiàn)不同的臨床致病特點，如在伊朗引起羔羊很高的致死率，在臺灣和日本引起牛亞臨床感染，且對豬的潛伏期可由通常的2-10d縮短為36h。目前，泛亞毒株已經(jīng)成為世界口蹄疫的優(yōu)勢毒株。但是2010年中國廣泛流行緬A株。2病毒傳播速度更快，造成的危害更大因為病毒變易，競爭優(yōu)勢毒株具備更強(qiáng)的入侵能力和更好的適應(yīng)環(huán)境變化的能力，從而實現(xiàn)跨國傳播。2003年3月，韓國、日本爆發(fā)口蹄疫，1個月后，病毒就進(jìn)入俄羅斯、蒙古；2001年英國爆發(fā)口蹄疫，1月后，就擴(kuò)散到愛爾蘭、法國、荷蘭，造成歐洲和世界口蹄疫的爆發(fā)。3非口蹄疫國家從新爆發(fā)口蹄疫14-15世紀(jì)，阿拉伯就有口蹄疫相關(guān)的報道；17-18世紀(jì)，德國、法國等歐洲大部分國家爆發(fā)口蹄疫；1845-1894年，歐洲嚴(yán)重流行口蹄疫，并擴(kuò)散至南美；亞洲口蹄疫流行僅次于非洲，居世界第2位，2000年前除韓國、日本、文萊、新加坡等島國，均有流行

2000年5月24日，OIE通過54個國家為非免疫無口蹄疫國家，其中歐洲占32個，美洲12個，亞洲4個，大洋洲4個，非洲2個。1997年臺灣，2000年韓國、日本，以及2001年英國是口蹄疫變異株在原為無口蹄疫國家爆發(fā)的例證。其中日本1908年，韓國1933年就已經(jīng)消滅了口蹄疫。三、我國口蹄疫流行歷史及現(xiàn)狀主要分為以下三個階段：上世紀(jì)50-60年代主要感染牛羊，豬占0.95%。第一次1950-1953年爆發(fā)，首次在新疆，1951年西北5省流行，后至華北、華中、華東、東北，共19省市；1952年四川阿壩流行；發(fā)病牲畜數(shù)百萬60年代起，口蹄疫疫情發(fā)生變化，豬感染比例迅速上升，70-80年代牛羊比例急劇下降，90年代豬的發(fā)病率達(dá)到歷史高峰，占總數(shù)的98%。1963年，由蘇聯(lián)、蒙古傳入O型口蹄疫（呼倫貝爾）1964年夏，蘇聯(lián)傳入A型口蹄疫（新疆、蒙古）同年，由新疆向內(nèi)地調(diào)運耕牛，沿途從新疆、甘肅、陜西、河南、安徽、山東等在21省市流行，數(shù)百萬頭發(fā)病近年來，又呈新特點（1）1999-2001年，我國爆發(fā)，以牛羊為主，由泛亞株引起，由印度及東南亞傳入我國邊境地區(qū)（2）2001-2002，我國口蹄疫回歸90年代“豬群毒”為主，泛亞株減少（3）2003年起，“豬群毒”和泛亞株并存（4）2005年6月和12月，江蘇、山東發(fā)生Asia-1口蹄疫，但被控制，沒有爆發(fā)四、診斷

由口蹄疫病毒引起偶蹄獸的急性、熱性、高度傳染性的動物疫病。OIE規(guī)定為A類傳染病，我國定為動物1類傳染病。1、病毒分離（1）病料采集家畜感染5天后，病畜食欲減退，體溫升至40℃，同時舌面水皰已形成，開始出現(xiàn)流延，此時是采集病料的最好時間。水皰皮、水皰液、食道及咽部分泌物。屠宰后的心臟、血液、肝、脾、肺等均可用于病毒分離。（2）樣品處理水皰液及血液樣品可直接用于分離，水皰皮及組織樣品要洗去甘油，磨碎，以PBS制成懸液（1：10），10000g離心，上清過濾即可接種。（3）分離病毒細(xì)胞分離FMV能感染的細(xì)胞有牛舌上皮、犢牛腎、甲狀腺、倉鼠腎、仔豬腎等細(xì)胞。PK、BHK等細(xì)胞系亦常用。動物分離小鼠和豚鼠常用于分離FMV。3~4日齡的乳鼠十分敏感。頸部皮下接種0.2ml，15h后出現(xiàn)口蹄疫的癥狀，如麻痹、呼吸緊張、心肌麻痹等。病毒滴度可達(dá)（LD50）可達(dá)107左右。

豚鼠選500g以上，病料處理后0.4ml接種后肢底部，48~72h后形成水皰。（LD50）可達(dá)106左右。2、血清學(xué)診斷Neutraliazationtest(NT)FMV與相應(yīng)抗體作用后，可失去感染力。可用已知抗體檢測待檢病原。FMV的檢測一般在乳鼠或細(xì)胞上進(jìn)行。NT還可用于FMV的分型。（1）固定血清稀釋病毒法（2）固定病毒稀釋血清法（3）乳鼠中和試驗（4）細(xì)胞中和試驗（5）空斑減少中和試驗反向間接血凝試驗以抗FMV抗體致敏紅細(xì)胞，再以之檢測相應(yīng)FMV。可用于病毒的分型。乳膠凝集試驗瓊擴(kuò)試驗主要用于測定抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗以不同血清型的純化FMV免疫豚鼠制備抗血清，經(jīng)純化后包被ELISA板，用以檢測相應(yīng)病毒，可用于FMV的分型。常用方法有間接法、夾心法等。夾心法以多抗包被，單抗夾心，效果良好。3、分子生物學(xué)診斷核酸雜交先制備特異FMV的核酸探針，以同位素或地高辛等標(biāo)記，利用堿基互補(bǔ)配對的原理進(jìn)行檢測。常用PCR方法擴(kuò)增FMDV的VP2或VP3基因的cDNA作為探針。PCR用于擴(kuò)增兩個已知序列間的DNA片段。FMV聚合酶基因中有454個基因是絕對保守的，選保守區(qū)兩端的序列分別作為引物。上游引物5-AGGACAAAGCGCTGTTCCGC-3下游引物5-TCAGGGTTGCAACCGACCGC-3另外，VP2、VP3基因具有型特異性，可用于病毒的分型。PCR檢測FMDV敏感、特異，理論上可檢測單拷貝基因。寡核苷酸指紋圖譜分析是核酸或核酸片段經(jīng)T1酶酶切后，經(jīng)電泳，少數(shù)大分子量片段在PAGE上分布的特點進(jìn)行比較。

T1酶的特點是在3-末端遇G就切開，故可將核算切成不同大小的片段。

優(yōu)點是比較簡便，敏感性高，能顯示出毒株之間的差異。常用于研究：毒株變異關(guān)系；大流行時病毒的起源、擴(kuò)散的去向和小流行時毒株的首發(fā)地，蔓延途徑；野毒株和疫苗毒株的比較等。五、口蹄疫的防制

（一）口蹄疫的預(yù)防措施防止國外傳入（1）禁止從有該病的國家輸入易感動物或產(chǎn)品。（2）進(jìn)口動物產(chǎn)品，必須經(jīng)過出口國家的政府獸醫(yī)機(jī)關(guān)檢疫，出具非疫區(qū)產(chǎn)品證明。（3）近3年內(nèi)。邊境地區(qū)發(fā)生口蹄疫，應(yīng)在邊境50~100公里的地帶，對易感的家畜普遍實施疫苗注射。（4）在國家規(guī)定的出入境口岸，設(shè)立動物檢疫機(jī)關(guān)，對出入境動物及產(chǎn)品進(jìn)行檢疫。（5）當(dāng)鄰國邊境發(fā)生口蹄疫時，實行邊境封鎖。（6）同鄰國簽定獸醫(yī)工作互助協(xié)定，溝通信息，共同撲滅疫情。國內(nèi)非疫區(qū)的預(yù)防（1）當(dāng)鄰近地區(qū)發(fā)生口蹄疫，應(yīng)對疫點周圍的易感動物進(jìn)行免疫預(yù)防。（2）關(guān)閉動物交易市場。（3）在交通要道設(shè)立檢查站，禁止從疫區(qū)運進(jìn)易感動物及產(chǎn)品。（4）受威脅的地區(qū)要管好畜群，不使其與病畜接觸。（5）防止各種媒介和傳播渠道傳入疫情。（6）建立疫病檢測網(wǎng)絡(luò)，有利于早、快、嚴(yán)、小消滅疫情。（二）撲滅口蹄疫的措施1撲殺全部病畜和同群牲畜。2緊急屠宰疫區(qū)病畜，但不銷毀，無害化處理后使用，在疫區(qū)周圍實施免疫注射。該方法在落后地區(qū)使用較多。3第三種辦法是對疫區(qū)實行嚴(yán)格的封鎖政策。這是常用的方法，特別是疫情擴(kuò)散后，采用該法。我國采用的是綜合防制的方法。（三）免疫預(yù)防預(yù)防接種是防制口蹄疫的有效方法。目前使用的是O+A型的油乳劑滅活疫苗。家畜斷奶后免疫，一月后加強(qiáng)免疫，可保護(hù)半年。但新疆已出現(xiàn)亞洲1型口蹄疫，且有擴(kuò)散趨勢。（三）免疫預(yù)防預(yù)防接種是防制口蹄疫的有效方法。目前使用的是O+A型的油乳劑滅活疫苗。家畜斷奶后免疫，一月后加強(qiáng)免疫，可保護(hù)半年。但新疆已出現(xiàn)亞洲1型口蹄疫，且有擴(kuò)散趨勢。

在國內(nèi)目前生產(chǎn)口蹄疫滅活疫苗的生產(chǎn)企業(yè)有六家，分別是中牧股份蘭州生物藥品廠、蘭州獸醫(yī)研究所中農(nóng)威特公司、金宇保靈生物藥品有限公司、新疆天康畜牧科技有限公司、乾元浩保山疫苗廠及上海申聯(lián)生物制品有限公司。其中上海申聯(lián)生物制品有限公司目前僅生產(chǎn)豬口蹄疫合成肽疫苗。已注冊用于生產(chǎn)豬口蹄疫滅活疫苗毒種主要有：