分光光度計和流式細(xì)胞儀介紹

吸光分光光度計

在光譜分析中，依據(jù)物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱為吸光光度法,主要有:

紅外吸收光譜：分子振動光譜，吸收光波長范圍2.51000m,主要用于有機化合物結(jié)構(gòu)鑒定。

紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200400nm（近紫外區(qū)），可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。

可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍400750nm，主要用于有色物質(zhì)的定量分析。

紫外可見吸收光譜1．光的基本性質(zhì)

光是一種電磁波，具有波粒二象性。光的波動性可用波長、頻率、光速c、波數(shù)（cm-1）等參數(shù)來描述：

=c

；波數(shù)=1/=/c

光是由光子流組成，光子的能量：

E=h=hc/

（Planck常數(shù)：h=6.626×10-34J×S)

光的波長越短（頻率越高），其能量越大。白光(太陽光)：由各種單色光組成的復(fù)合光

單色光：單波長的光(由具有相同能量的光子組成)

可見光區(qū)：400-750nm

紫外光區(qū)：近紫外區(qū)200-400nm

遠(yuǎn)紫外區(qū)10-200nm（真空紫外區(qū)）2.物質(zhì)對光的選擇性吸收及吸收曲線M+熱M+熒光或磷光

E=E2-

E1=h

量子化；選擇性吸收;

分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使其對不同波長光的吸收程度不同；

M+

h

M*基態(tài)激發(fā)態(tài)E1

（△E）E2吸收曲線的討論：（1）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似λmax不變。而對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同。

（2）吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一。（3）不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。光的吸收定律朗伯—比耳定律

布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系。A∝b

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系。A∝c

二者的結(jié)合稱為朗伯—比耳定律朗伯—比耳定律數(shù)學(xué)表達(dá)式

A＝lg（I0/It)=εbc

式中A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；

b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

c：溶液的摩爾濃度，單位mol·L－１；

ε：摩爾吸光系數(shù)，單位L·mol－１·cm－１；

或:A＝lg（I0/It)=abc

c’：溶液的濃度，單位g·L－１

a：吸光系數(shù)，單位L·g－１·cm－１

a與ε的關(guān)系為：

a=ε/M

（M為摩爾質(zhì)量）透光度(透光率)T透過度T:描述入射光透過溶液的程度:

T=It/I0吸光度A與透光度T的關(guān)系:

A

＝－lgT

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測定的依據(jù)。應(yīng)用于各種光度法的吸收測量；流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線流動狀態(tài)中的單個細(xì)胞的多項物理及生物學(xué)特性，加以分析定量的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選。散射光信號

當(dāng)細(xì)胞顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（FSC）。與激光束垂直的稱為側(cè)向角散射光信號（SSC）。散射光信號RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

細(xì)胞相對大小及其表面積

側(cè)向角散射光（SSC,SideScatter）

細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性前向角散射光信號側(cè)向角散射光信號外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點圖

（紅細(xì)胞溶解后）

顆粒雜質(zhì)、氣泡對檢測的影響熒光信號