課件教程講稿

修飾設(shè)計：使用penoeTMkit使胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的步驟如下。中等溫度堿性pH下使DNA變性成為單鏈形式出堿基。試劑一，一種包含亞硫酸氫根的鈉鹽，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脫氨，產(chǎn)生一種尿嘧啶磺酸鹽中間產(chǎn)物。然后DNA在另一種鹽﹙試劑二﹚存在的條件下不一種微粒載體﹙試劑三﹚結(jié)合，并通過重復(fù)離心和在70%的乙醇中重懸浮脫鹽。向尿嘧啶的轉(zhuǎn)化是通過在90%的乙醇中反復(fù)堿性脫磺酸基作用和脫鹽完成的。DNA最終在TE緩沖液中通過加熱從載體上洗脫下來。（1）3MNaOH（用前現(xiàn)配把1g干NaOH片劑溶解在8.3mL水中。使用此類腐蝕性堿，注意謹慎和實驗作（2）20mMNaOH/90%EtOH（用前現(xiàn)配溶解試劑Ⅰ（用前現(xiàn)配打開前將試劑瓶加溫至室溫。對每份待修飾的樣本，稱取0.227gDNA修飾試劑Ⅰ加入0571L水中。充分渦旋振蕩混合。使用該試劑時要謹慎，因為它對呼吸系統(tǒng)和皮膚有刺激性。用大約20l3MNaOH調(diào)整pH至50，用pH試紙檢測pH值。試劑Ⅰ避光保存以免分解。為了最佳效果，試劑應(yīng)在配置后立即使用。溶解試劑Ⅱ打開前將試劑瓶加溫至室溫。將1μlβ-巰基乙醇加入20mL去離子水中。每份待修飾DNA750μl1.35gDNA的試劑可用箔紙包裹的容器、2℃-8℃、避光保存長達6周。第二步：DNA修飾程序1、在帶有螺旋形瓶蓋的1.5-2.0mL的微量離心管中：將7.0μl3MNaOH加入到含有DNA1.0μgDNA2μlDNA劑Ⅳ并加水至總體積100μl。再加入7.0μl3MNaOH并混勻。3550μl新鮮配制的DNA 強力渦旋振蕩懸浮DNA修飾Ⅲ。用10x的1mL塑料秱液管槍頭來回吸排懸液2 向含DNA溶液的管中加入5μl充分懸浮的DNA修飾試劑Ⅲ3 加入750μlDNA修飾試劑Ⅱ并充分混勻4 室溫孵育5-10分鐘 5000Xg離心10秒使DNA試劑Ⅲ成顆粒狀。（應(yīng)出現(xiàn)一種白色的小顆粒。） 加入1.0mL70%的乙醇，渦旋振蕩，5000Xg離心10秒，棄去上清。該步驟重復(fù)進行，共3次。7 將第三次上清棄去后，離心管高速離 分鐘，用塑料秱液管槍頭秱?cè)ナＳ嗲宓谒牟剑和瓿?修飾（脫磺酸基作用），再次脫鹽，并洗脫1 適量樣本加入50μl20mMNaOH/90%EtOH溶液2 充分渦旋振蕩懸浮顆粒，再室溫孵育5分鐘3 4、第二次洗脫除去上清后，高速離心樣本3分鐘5、用塑料秱液管頭除去所有剩余上清。試管室溫10-20鐘（必須除去6、加入TETEDNA25μlTE1μgDNA40ng/μl。7、50-60℃下樣本孵育15分鐘以洗脫DNA8、高速離心2-3分鐘并用塑料秱液管頭轉(zhuǎn)秱樣本（上清）到新管。9、進行MSP或，或-15～-25℃可保存達2個月，-80℃可保存6個月。避免重復(fù)融化和解凍；可分量。丌要將DNA在自動除霜冰箱。 當從一管中轉(zhuǎn)秱已解凍的DNA以備用時避免將試劑Ⅲ轉(zhuǎn)秱到PCR反應(yīng)管中。三、（1）運用特別設(shè)計的針對甲基化和非甲基化序列的引物，引物由生物工表表 甲基化引物序列及擴增條hMLH1引 引物序列溫甲基化(M)正 115甲基化(M)反 115非甲基化(U)正 124非甲基化(U)反 124（2）PCRa10×PCR5μl，2.5mmol/LdNTP4μl，甲基化上下游引物和去甲基化上下游引物分別為1μl，甲基化模板DNA5μl，Taq酶0.25μl，加水至總體積50μl。b循環(huán)條件：程溫時60變30退3060 產(chǎn)物結(jié)果判定：瓊脂糖凝膠電泳甲基化陽性：甲基化特異性引物擴增出相應(yīng)長度的片斷，但非甲基化特異性引物未擴增出相應(yīng)長度的片斷，則判斷啟動子區(qū)5’pG島甲基化陽性。甲基化：非甲基化特異性引物擴增出相應(yīng)長度的片斷，但甲基化特異性引物未擴增出相應(yīng)長度的片斷。則判斷啟動子區(qū)5’pG島甲基化。生物實 ，細胞、分子生物學(xué)、蛋白檢測技術(shù)實點擊進 點擊進入淘寶生物實驗，細胞、分子生物學(xué)、蛋白檢測技術(shù)實驗，約7G大小，22本套實驗制作耗資上百萬，由專業(yè)的影視和后期制作團隊拍攝+生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的教授專家指導(dǎo)+Thermo、oche等著名企業(yè)參與共同制作完成。分子生物學(xué)實驗技術(shù)共6個，包括:DNA甲基化檢測、分子克隆技術(shù)、高分辨溶解曲線（HRMPCRQPCR（ISH蛋白檢測技術(shù)共6個，包括:TUNEL法檢測細胞凋亡、酶聯(lián)接免疫吸附測定（ELISA免疫印跡法（Westernbotting、免疫組化（IHC、凝膠遷移實驗（EMSA、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Ch