乙肝診斷技術(shù)新進展

乙肝診斷技術(shù)新進展目前乙型肝炎實驗室診斷中存在的問題

單獨用HBsAg作為判定是否感染乙肝病毒的指標并非完全準確

理論基礎：

①

HBV/HCV合并感染，抑制HBsAg表達

②144、145位等氨基酸變異國內(nèi)外ELISA試劑檢測HBsAg比較野生型

ad相差約8倍

ay相差約16倍

變異型對G145R變異及與其相關(guān)的多點變異的檢測能力弱,或檢不出；對T118K/P120Q，Q129R/M133T等聯(lián)合變異的檢測能力弱；對于T126N，D144A等變異國內(nèi)外試劑的檢測能力基本一致。國內(nèi)外診斷試劑對變異血清的檢測國家參考品adr血清的檢測結(jié)果含有G145R變異的血清檢測結(jié)果變異血樣目前乙型肝炎實驗室診斷中存在的問題

單獨用HBeAg診斷活動期乙肝并不可靠。

理論基礎：前C區(qū)變異為什么會出現(xiàn)HBeAg陰性HBeAg陰性是由于HBV變異造成：常見的是前核心區(qū)和核心啟動子區(qū)的變異前核心區(qū)G1896A

突變使前核心區(qū)出現(xiàn)終止密碼，導致E抗原不能合成前體氨基酸異位核心啟動子區(qū)A1762T+G1764A

突變造成信號RNA轉(zhuǎn)錄降低，導致HBeAg不能分泌，血清中檢測不到HBeAg前C區(qū)的基因突變當乙肝病毒為逃避宿主的免疫反應基因可發(fā)生變異。其所攜帶的HBV變異毒株大多數(shù)表現(xiàn)為：在病毒基因組前C區(qū)末端1896位發(fā)生

G–A點突變

TGG

TAG

恰好形成新的終止密碼子（TAG）阻斷了HBeAg的轉(zhuǎn)錄，翻譯，表達導致在臨床上可出HBeAg檢測為陰性。但HBV病毒仍能復制和裝配ExpressionofcoreproteinandHBeAg前C區(qū)變異前C區(qū)發(fā)夾形纖襻結(jié)構(gòu)，在1858位與1896位間，將不穩(wěn)定的T－G對變異為T－A對，使前基因組RNA結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，更有利于病毒復制，進而導致優(yōu)勢株。全世界HBeAg陰性的患者中有60％被檢測到前C終止密碼變異，在地中海為92％，亞太地區(qū)是50％，美國北歐為24％CumulativeeffectofCorepromotermutations

C區(qū)變異

在病毒清除期，基因組較保守的部位發(fā)生了選擇性變異，以C區(qū)中部的變異或缺失，至少可涉及4個B細胞靶位、2個細胞毒T細胞（CTL）表位和3個Th細胞表位。

C區(qū)Codon130是最重要的免疫原性區(qū)，是T、B細胞共有的表位。干擾素治療HBeAg陰性的慢性乙肝持續(xù)的反應率較低，而在HBeAg陽性患者干擾素療效較好，當患者血清HBV前C基因突變株超過20％時，常預示IFN－α療效差，在慢性HBV感染過程中，前C1896變異毒株逐漸累積成為優(yōu)勢毒株，因此，臨床應用干擾素治療越早越好

X基因的變異

X基因是病毒復制的重要調(diào)節(jié)區(qū)，是轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄和正鏈合成的起點，也是多種細胞因子結(jié)合點，此區(qū)變異影響到病毒的轉(zhuǎn)錄和復制：核心蛋白的啟動子（BCP）慢性乙型肝炎：BCP變異是多點和復合，主要是1762（A－T）、1764（G－A）的雙變異，BCP區(qū)是富含AT區(qū)域，具有肝臟富含因子的獨立結(jié)合點，變異的BCP可改變這種結(jié)合，降低前C的RNA轉(zhuǎn)錄，最終使HBeAg表達減少，平均降低70％。暴發(fā)型肝炎患者CP1638位（T－C）、1673位（C－T）、1727位（A－T）、1730位（C－G）變異出現(xiàn)較多

S基因變異

乙肝疫苗免疫HBsAg(+)，“a”決定簇變異株，其中145位的甘氨酸替代了精氨酸，這是由于HBV逃避宿主的免疫壓力選擇性結(jié)果，有時這種變異株在母體內(nèi)為少數(shù)，而在疫苗免疫后的小兒卻成為優(yōu)勢株肝移植后應用單克隆抗體或高效價HBsAg治療后也可出現(xiàn)145位的甘氨酸－精氨酸HBsAg變異。還有在HBsAg－、DNA＋患者中發(fā)現(xiàn)124位半胱氨酸缺失，導致HbsAg的分泌障礙，而使免疫學標志出現(xiàn)HBsAg－。乙肝病毒臨床與變異慢性感染HBeAg（＋）期，病毒高滴度，但臨床常無加重

隨著感染持續(xù)，出現(xiàn)了HBeAg(－)前C變異株，并逐漸累積，此時血清學仍可為HBeAg(＋)，但血清中已可同時檢測野毒株和變異株，其中野毒株逐步被清除，臨床上常伴肝炎發(fā)作；隨著前C1896變異株選擇優(yōu)勢的發(fā)展，血清學可轉(zhuǎn)換為HBeAg(-)，但在血清中仍可檢測到HBeAg分泌的野毒株，在臨床上既可表現(xiàn)為病情加重，也可表現(xiàn)為病情緩解；若選擇的結(jié)果進入均一eAg不表達的變異株，則ALT可輕微升高，但病情可無明顯加重。目前乙型肝炎實驗室診斷中存在的問題

DNA復制程度的大小并不代表肝臟實際損害的程度（莊輝院士）,DNA不能準確的判斷愈后，轉(zhuǎn)陰后可能反彈。

附：DNA與ALT的關(guān)系DNA與ALT的關(guān)系首都醫(yī)科大學閔福援

39例急性乙肝患者血清HBV-DNA與ALT間的動態(tài)變化時間（周）例數(shù)HBV-DNA陽性例數(shù)（%）ALT大于40U/L例數(shù)（%）1-53935（90%）30（76%）6-103525（71%）9（25%）11-30217（33%）2（10%）

不同病程的HBV-DNA與ALT相比差異有顯著性。目前乙型肝炎實驗室診斷中存在的問題

單獨DNA檢測并不能準確反映乙肝病毒的復制情況，部分活動期乙肝患者DNA檢測結(jié)果呈陰性?？陀^評價乙肝病毒DNA檢測

在臨床診斷中的意義

擴增乙肝C基因區(qū)上270bp基因片段，以2n

指數(shù)，將HBV-DNA分子片斷擴增1×107～108倍同一位患者抽血檢查HBV-DNA，其定量數(shù)值每天都在變化，即便是患者不進行任何治療，定量檢測到的數(shù)值都在時刻變化之中。同一份血清標本在不同的時間檢測，或在不同的實驗室檢測，其數(shù)值都會有所不同。以這種時刻都在自然變化著的數(shù)值用來說明療效，是不確切的。HBV-DNA定量檢測所用儀器設備、試劑品質(zhì)不同，標準曲線以及標準熒光等各不相同，得出的數(shù)值左右漂浮，偏差大，得出的檢測值范圍也不相同

DNA載量---隨時變化的不穩(wěn)定數(shù)值：可能是治療效應，也可能是自然變化或檢驗偏差。DNA載量正常值和異常值范圍難以統(tǒng)一PCR-血清標本的處理目的基因的得率：①處理標本過程中目的基因的得率問題，在一定范圍內(nèi)還可以提高PCR法的特異性。②不同的抽提方法，DNA得率不同;

因此，如果沒有統(tǒng)一的血清標本處理方法，那么基因定量檢測的準確性如何得到保證呢？這個問題在作PCR定量時顯得尤為突出。

定量PCR法的原理是把“反應管”中的目的基因指數(shù)級地擴增到一定水平，再通過產(chǎn)物雜交，并與設定的內(nèi)參照對比，推算“反應管”內(nèi)的目的基因含量，并不等于原待測標本內(nèi)的真正含量，因此血清標本處理過程種的目的基因的丟失及丟失量均無法計算。由于基因突變所致PCR法假陰性的問題慢活肝，血清HBVDNA檢測陰性？

PCR引物設計原則：篩選出陽性率“最高”的一對引物從整體上看，PCR的漏檢率可能很低，但漏檢如果發(fā)生在某一個具體病人則是100%。第一，我們有沒有更積極的措施，最大限度地減少假陰性？第二，臨床醫(yī)生是否對DNA檢測技術(shù)的局限性有足夠認識？是不是僅憑一張檢驗報告的陽性或陰性結(jié)果，作出HBV感染是與否的判斷？基因檢測和免疫學檢測技術(shù)具有互補性

基因檢測判斷病原體的有無和量的多少

機體作出了何種反應？程度如何？反應的結(jié)果如何？preS1對乙肝診斷的獨特作用1、preS1作為嗜肝侵蝕性的標志與HBsAg同時檢測；結(jié)果相互印證，診斷乙肝更準確。夾心法測PreS1抗原PreS1PreS2HBsAgpreS1對乙肝臨床診斷的獨特作用2、解決HBeAg漏檢帶來的誤診，提供判斷病毒復制的可靠指標。HBsAg

(＋)組preS1抗原和HBeAg的關(guān)系試驗單位HBsAg

(＋)HBeAg(+)Pre-S1(+)A247例86（34.8％）157（63.6％）B245例77（31.4％）145（59.2％）C328例115（35.1％）217（66.1%）合計820例278（33.9%）519（63.3％）前S1抗原與E系統(tǒng)的關(guān)系HBeAg合計+-PreS1+330197527-89300389合計419497916PreS1陽性組中HBeAg陽性率62.6%;HBeAg陰性組中PreS1陽性率39.6%;前S1抗原與E系統(tǒng)以及DNA的關(guān)系PreS1抗原（＋）HBV-DNA（＋）HBeAg+83.97%(1226/1460)86.70%(554/639)_48.54%(1099/2265)60.69%(315/519)前S1抗原與E系統(tǒng)以及DNA的關(guān)系PreS1抗原（＋）HBeAg（＋）HBV-DNA+84.9%(653/769)58.6%(450/769)_9.5%(37/389)12.1%(47/389)preS1對乙肝臨床診斷的獨特作用3、彌補乙肝DNA檢測的假陰性

在已經(jīng)開展DNA檢測的單位，如果DNA陰性的病例，建議加查PreS1,這時如果再有ALT陽性，高度懷疑肝炎活動期。Expressionof3co-terminalenvelopeproteinsofHBVpreS1對乙肝臨床診斷的獨特作用安徽阜陽肝病研究所張金良

---313例慢性肝炎患者PreS1抗原和DNA檢測數(shù)據(jù)比較血清免疫標志物模式例數(shù)HBV-PreS1陽性例數(shù)（%）HBV-DNA陽性例數(shù)（%）HBsAg+HBeAb+HBcAb+14078（55.71%）41（29.29%）HBsAg+HBcAb+173118（68.21%）79（45.66%）preS1對乙肝臨床診斷的獨特作用

4、preS1與肝損傷直接相關(guān)，判斷治療效果比DNA更準確。preS1對乙肝臨床診斷的獨特作用首都醫(yī)科大學閔福援

39例急性乙肝患者血清HBV-DNA與ALT間的動態(tài)變化時間（周）例數(shù)HBV-DNA陽性例數(shù)（%）PreS1陽性陽性例數(shù)（%）ALT大于40U/L例數(shù)（%）1-53935（90%）26（67%）30（76%）6-103525（71%）11（31%）9（25%）11-30217（33%）3（14%）2（10%）不同病程的HBV-DNA與ALT相比差異有顯著性，而PreS1抗原與ALT相比無顯著差異，PreS1抗原可以判斷治療效果。PreS1先于DNA轉(zhuǎn)陰提示預后良好。

5、PreS1抗原在AHB病程中先于HBV-DNA轉(zhuǎn)陰，較早預示病情好轉(zhuǎn)，可用于判斷預后，比DNA更有意義。preS1對乙肝臨床診斷的獨特作用診斷用基因工程抗體分子的制備基因工程抗體的優(yōu)勢抗體分子超變區(qū)點突變

--------使得抗體活性高于天然分子抗體，從而提高試劑的敏感度?？贵w分子恒定區(qū)改造

-------避免人抗鼠抗體的干擾，有效提高了試劑的特異性。傳統(tǒng)preS1診斷試劑存在的問題傳統(tǒng)preS1診斷試劑抗體位點不全，影響檢出率。與DNA檢測結(jié)果符合率較低一步法的試劑敏感度低，影響對乙肝的正確診斷。威高生物preS1診斷試劑的特點獨家采用基因工程抗體新技術(shù)。準確度高，真正發(fā)揮PreS1的診斷優(yōu)勢。提高乙肝診斷的準確性，維護醫(yī)生和檢驗師的良好聲譽。傳統(tǒng)preS1試劑

威高新一代preS1試劑項目傳統(tǒng)preS1診斷試劑威高基因工程抗體preS1診斷試劑核心技術(shù)單克隆抗體基因工程抗體HBeAg陰性PreS1陽性率20~40%50~60%與DNA符合率60~70%80~95%對比總結(jié)傳統(tǒng)preS1試劑

威高新一代preS1試劑血清例數(shù)傳統(tǒng)preS1試劑威高preS1試劑乙肝DNA53陰性陽性陽性2陰性陽性陰性性能對比研究不同質(zhì)量preS1試劑

對乙肝診斷的準確性影響很大模式例數(shù)DNA陽性率某preS1試劑（兩步法）某preS1試劑（一步法）HBsAg+HBeAg+7197.2%70.4%31.0%HBsAg+HBeAg-15657.1%39.1%16%華中科技大學同濟醫(yī)院彭靜《臨床檢驗雜志》2006年第3期檢驗兩對半為何還要查Pre-S1？

1．前S1抗原出現(xiàn)在急性乙型肝炎感染的早期，在轉(zhuǎn)氨酶升高前即可查出，提示可作為早期診斷乙肝病毒感染的指標。

2．急性乙型肝炎患者前S1抗原陰轉(zhuǎn)越早，預后越好，是病毒清除的最早跡象。反之，前S1抗原持續(xù)陽性，將發(fā)展至慢性肝炎。（比HBeAg陰轉(zhuǎn)、HBsAb陽轉(zhuǎn)指標提示要早）。

3．HBeAg（-）慢性乙型肝炎約占慢性乙肝的30%-50%，檢測前S1抗原，提示病毒在機體內(nèi)繼續(xù)復制，此類患者更容易演變?yōu)楦斡不蚋伟?。加查前S1抗原，彌補了因HBeAg缺失造成的診斷和治療困難。

4．在HBV無癥狀攜帶者中，有一定比例的HBeAb（+）者，加查前S1抗原（+）提示病毒在體內(nèi)還較活躍。病毒并沒有清除，肝臟還有潛在的病理損傷的可能。

5．抗病毒治療乙型肝炎，加查前S1抗原可作為治療前的患者篩查和治療后的療效判斷，尤其對HBeAb（+）的慢性肝炎患者抗病毒治療的排查也起到重要作用。

所以檢驗兩對半，加查前S1抗原可在急性肝炎，慢性肝炎，HBV無癥狀攜帶者和抗病毒治療乙型肝炎診療過程中起到十分重要的作用。

為什么檢測HBV-DNA還要檢測前S1抗原？

1．在病毒感染機體的整個周期中，前S1蛋白的獨特功能，使其能夠較充分的反應機體的體液免疫狀況，直至病程的轉(zhuǎn)歸過程,如早期診斷，急性肝炎前S1抗原陰轉(zhuǎn)是病毒清除的最早跡象，反之疾病將發(fā)展至慢性肝炎等臨床診斷以及前S1抗原陰轉(zhuǎn)，前S1抗體出現(xiàn)等免疫學反應）這是單一測定HBV-DNA所不能做到的。

2．免疫測定技術(shù)因其有效、直接、簡便的特點，已經(jīng)在臨床診斷應用上