生物工藝學基因工程工具酶

第二章基因工程工具酶

基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內切酶，連接酶，DN聚合酶等)作為工具對基因進行人工切割，拼接和擴增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。工具酶是對野生菌株（或真核生物如酵母）進行改造、優(yōu)化、而產生的生物工程產品。

基因工程工具酶

自然界的許多微生物體內存在著一些具有特異功能的酶類。這些酶類參與微生物的核酸代謝，在核酸復制和修復等反應中具有重要作用，有的酶還作為微生物區(qū)別自己和非己的DNA進而降解非己

DNA的防御工具。在研究掌握了利用這些酶類對基因切割、拼接操作方法后，人類獲得了最好的基因工程工具?；蚬こ坦ぞ呙富蚬こ坦ぞ呙讣捌鋺孟拗菩院怂醿惹忻浮饕糜贒NA分子的特異切割DNA連接酶—用于DNA和RNA的連接DNA聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化其它酶類--用于生物細胞的破壁、轉化、核酸純化、檢測等。限制性核酸內切酶(restrictionenzyme)限制性核酸內切酶(restrictionenzyme)限制性內切酶的發(fā)現(xiàn)

限制性內切酶的分類

限制性內切酶的命名

限制性內切酶的活性單位

限制性內切酶的切割特點

限制性內切酶的反應條件

限制性內切酶的應用

一

.限制性內切酶的概念核酸酶可分為兩類：核酸外切酶（exonuclease）是從核酸的一端開始，一個接一個把核苷酸水解下來；核酸內切酶(endonuclease)則從核酸鏈中間水解3’，5’磷酸二酯鍵，將核酸鏈切斷。限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)

細菌的限制—修飾作用1952年，Luria

和

Human，1953年，Bertani

和

Weigle

發(fā)現(xiàn)細菌的限制（restriction）現(xiàn)象：Phageλ（k）

E.colikE.coli

B【E.coliB限制

λ（k）】感染不感染噬菌體侵染細菌噬菌體侵染細菌

仍有少量phageλ(K)可在

E.coliB中生存，是因為E.coliBphage對λ(K)進行了修飾。大腸桿菌B大腸桿菌K修飾的phageλ(B)修飾的phageλ(K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修飾作用）R-M系統(tǒng)

細菌中存在位點特異性限制酶和特異性甲基化酶，構成了寄主控制的限制—修飾系統(tǒng)

(R-MRestriction-modificationsystem)。

R-M系統(tǒng)是細菌安內御外的積極措施。細菌

R-M系統(tǒng)的限制酶可以降解

DNA，為避免自身

DNA的降解，細菌可以修飾（甲基化酶）自身

DNA，未被修飾的外來

DNA則會被降解。

個別噬菌體在被降解之前已經發(fā)生了修飾，則可免予被降解。

限制性內切酶的發(fā)現(xiàn)限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)1968Linn和

Arber

從

E.coliB中發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅰ

1970Smith（美）在流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans

因發(fā)現(xiàn)限制性內切酶及對其功能研究的突出貢獻獲得諾貝爾獎金限制性核酸內切酶（限制酶）：在細胞內能夠識別雙鏈

DNA分子中的特定核苷酸序列，并對

DNA分子進行切割的一種酶。功能：降解不同源

DNA，而不降解同源

DNA。EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號

若種名頭2個字母相同則其中一個可用種名的第一和第三個字母。

限制性核酸內切酶的命名限制性核酸內切酶的活性單位50μLBuffer中，含1μg底物DNA，于最適反應條件和溫度下，保溫1小時，能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即為一個酶單位，用U表示。buffer（pH=8.0）：50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巰基乙醇100μgBSA/ml（DDT：二硫蘇糖醇BSA：牛血清蛋白)限制性核酸內切酶的切割特點在

DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位，切割

DNA分子，產生鏈的斷裂。2個單鏈斷裂部位在

DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對。斷裂結果形成的

DNA片段，具有互補的單鏈延伸末端。識別序列

絕大多數的Ⅱ型限制性核酸內切酶都能夠識別由4-8個核苷酸組成的特定的核苷酸序列。限制性核酸內切酶就是從其識別序列內切割DNA分子的，因此這些識別序列又叫核酸內切酶的切割位點或靶序列。

識別序列有連續(xù)的（如GATC）和間斷的(如GANTC)兩種，它們都呈回文結構。ABCC’B’A’

A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’

ABB’A’

ABB’A’

或或EcoR

Ⅰ5‘……GAATTC……3’

3’……CTTAAG……5’

不同核酸內切酶的特異識別位點PstⅠ5’……CTGCAG……3’

3’……GACGTC...…5’

AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位點核酸內切酶HindⅢ對雙鏈DNA分子的切割作用三、種酶切末端

平齊末端（如

SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）

5’-GGCC-3’

3’-CCGG-5’

5’-GG--CC-3’

3’-CC--GG-5’

5’粘性末端（如

EcoR

Ⅰ）

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

5’-G--AATTC-3’

3’-CTTAA--G-5’

3’粘性末端（如

Pst

Ⅰ）同裂酶和同尾酶

同裂酶：來源不同的限制酶識別相同的核苷酸靶序列。產生同樣的切割，形成同樣的末端。

如：HpaⅡ和MspⅠ均可切割CCGG。當胞嘧啶甲基化后，

MspⅠ不能再切割。

同尾酶：來源不同，識別的核苷酸靶序列也不相同，但切割后

DNA分子產生的粘性末端相同的限制性核酸內切酶。5’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’

BamHⅠ5’-TGATCA-3’

3’-ACTAGT-5’

BclⅠ5’-AGATCT-3’

3’-TCTAGA-5’

BglⅡBamHⅠ

BclⅠ

BglⅡ三種酶可產生相同的

5’GATC粘性末端，由這種同尾酶產生的

DNA片段可因粘性末端的互補而彼此再連接起來。限制性核酸內切酶的反應條件1.底物

DNA

（1）DNA純度:RNA與

E結合影響有效酶濃度；

（2）DNA濃度:[DNA]過大，抑制酶活，影響酶分子擴散

如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃15h1μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃1h

（3）識別位點及鄰近位點特異性序列

如：pBR322DNA有

4個

NarⅠ切點

(GGCGCC)其中

2個切點用1U酶水解

1h完全切開,2個切點用50U酶水解

16h水解不完全。

XmaⅢ

切點（CGGCCG）在GGCGGCCGCC時不切割。（4）DNA二級/三級結構

如：超螺旋

DNA(病毒或質粒)比線狀

DNA需酶多（5）提取時混入雜質可改變識別特異性

如：

高濃度

Hg2+、酚、

氯仿、乙醇、EDTA、

SDS、NaCl

等。

2.反應系統(tǒng)因素

（1）緩沖液（無菌、無污染）（2）金屬離子

如：Ⅱ型酶需

Mg2+，若以

Mn2+代替Mg2+（如HindⅢ，EcoRI）則特異性改變。

離子濃度不合適會抑制酶活。（3）牛血清蛋白

(BSA)

BSA是酶穩(wěn)定劑，可避免熱、表面張力、化學品導致的酶變性。過量

BSA會引起電泳拖尾。限制性核酸內切酶的反應條件3.星活性

限制性內切酶識別特異性放寬。

EcoRⅠ在正常情況下識別

GAATTC序列發(fā)生切割，但如果緩沖液中甘油濃度超過

5%，其識別位點發(fā)生松動，可在

AATT處發(fā)生切割，EcoRⅠ這種特殊的識別能力叫做星活性，用

EcoRⅠ*表示。星活性可造成位點切割機率不等，降解不完全。

影響因素：甘油濃度

12-20%，酶與

DNA比例，離子強度，45%聚乙二醇

(PEG)，有機溶劑，8%二甲基亞楓，二價陽離子，12%乙醇。限制性核酸內切酶的反應條件重組DNA前的切割

構建新質粒構建物理圖譜DNA分子雜交

用限制性內切酶消化受體DNA制備DNA探針

亞克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究

限制性核酸內切酶的應用重組DNA前的切割

構建新質粒構建物理圖譜DNA分子雜交

用限制性內切酶消化受體DNA制備DNA探針

亞克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究

限制性核酸內切酶的應用

甲基化酶分兩類：

維持性甲基化酶：用于在新合成的

DNA鏈上進行甲基化的酶。甲基化位置與模板鏈上的相同。構建性甲基化酶：用于在非甲基化的

DNA鏈上進行甲基化的酶。

用甲基化酶進行甲基化的作用封閉

DNA鏈中的某些識別位點，保護多余的限制性酶切位點。構建新的酶切位點DNA連接酶（ligase）

能夠催化

DNA中相鄰的

3’-羥基和

5’-磷酸基末端之間形成3′，5′-磷酸二酯鍵;T4DNA連接酶

可連接帶匹配粘性末端的

DNA分子，也可使平端的雙鏈

DNA分子相互連接。大腸桿菌

DNA連接酶

只能連接帶匹配粘末端的

DNA分子.ds-DNA結構:切口,缺口,斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′

5′5′5′(1)(2)AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′5′AATTC······GG······CTTAA5′

5′(a)分子間連接(b)分子內連接(1)(2)ATGCTATAGCTAT4連接酶T4連接酶一.DNA的連接方法兩種不同的DNA分子可以經過下述的方法之一進行連接,而方法的選用則是根據其兩者末端的DNA結構.1.直接連結法---該法適用于:1)

同種限制酶作用不同DNA片段產生的相同粘性末端

重組DNA可用同種酶再切開2)不同種限制酶作用不同DNA片段產生的相容性末端

i.重組DNA分子不能再為這兩種酶所作用,如:BamHI/BglIIii.重組DNA分子可為其中一種酶所作用,但為另一種酶作用的可能性較小,如MboI/BamHI3)PCR產物與特定載體的連接

4)限制酶和其他方式產生的平末端.2.人工接頭連接法1)人工接頭（linker）的結構

i.中軸對稱互補,可自行退火形成雙鏈.如:5'-CCGGAATTCCGG-3'3'-GGCCTTAAGGCC-5'ii.至少有一特定的限制酶識別位點

iii.某種限制酶的一套人工接頭可使插入片段與表達載體保持同相.如:

八聚體d(GGAATTCC)

十聚體d(CGGAATTCCG)

十二聚體d(CCGGAATTCCGG)2)用途

i.平整末端的連接(各種結構的DNA末端均可經過修飾變成平整末端)2X5'-CCGGAATTCCGG-3'退火

ii.產生新的克隆位點

iii.合成匹配接頭3)連接方法

人工接頭磷酸化退火形成雙鏈與目的DNA相連限制酶切兩DNA分子相連4)適用范圍

人工接頭連接法適合于那些只有一種DNA片段需加人工接頭就可以與另一DNA分子相連的DNA分子.利用人工接頭也可使任意兩個平端的DNA分子相連.這種直接相連的辦法簡便,快速,但最后連接起來的DNA可能具有不同的結構.為避免這些結構的產生,可先使一種DNA先加上人工接頭后,再與另一種DNA分子相連.3.匹配接頭連接法人工接頭雖然可連接兩個具不同末端的DNA分子,但這些末端在加入人工接頭前必須變?yōu)槠秸┒?然而,有時實驗不容許使用人工接頭或使用人工接頭不方便,此時,便可使用匹配接頭,它可用于直接連接各種具不同末端的DNA分子:i.平端+突起末端(5’-突起,3’-突起)ii.粘性末端(5’-突起+5’-突起:EcoRI+HindIII5’-突起+3’-突起:EcoRI+PstI3’-突起+3’-突起:PstI+SacI)1)

匹配接頭的結構特點

i.

由兩個低聚核苷酸組成

ii.部分區(qū)域可以互補

iii.退火后的雙鏈低聚核苷酸可以形成兩個不同的末端2)

匹配接頭的種類

i.

預制匹配接頭(連接平端和粘性末端)

人工接頭+匹配接頭預制匹配接頭

ii.轉換匹配接頭(連接5’-突起和3’-突起末端)

二匹配接頭退火轉換匹配接頭二人工接頭連接酶雙酶切轉換匹配接頭

iii.單鏈匹配接頭(連接5’-突起和3’-突起末端)4.同聚物加尾連接法在兩個不同的DNA分子末端各加上一個可互補的同聚物,即AT或GC.5.連接方法的選擇方法選擇的依據:1)兩DNA分子的末端結構

2)DNA分子的限制酶譜

3)是否需要回收DNA片段連接方式的選擇載體末端外源DNA末端常規(guī)連接脫磷酸化同聚物平端連接補齊,人工接頭

結構結構載體加尾外切酶

5’-突起相容5’-突起第二選擇第一選擇不能不能不能

5’-突起非相容5’-突起不能結合使用接頭不能不能第一選擇

3’-突起相容3’-突起唯一選擇不能不能不能不能

3’-突起非相容3’-突起不能不能第一選擇不能第二選擇或平端

3’-突起5’-端突起不能不能第一選擇不能第二選擇

(補齊后)

平端平端不能可能可能第一選擇可能平端3’-或5’-突起不能不能第一選擇不能第二選擇二.DNA的連接反應

1.

連接反應理論當兩種DNA分子相連時,它們可能產生不同的結果,這些結果與以下因素有關:1)

連接反應系統(tǒng)中的總DNA濃度i2)

一個DNA分子靠近同一分子另一端的有效濃度j,該值與DNA的長度成反比,即DNA分子越大,該分子的兩末端越不易相互作用(即自身環(huán)化)3)

兩種不同DNA分子的克分子濃度之比值.2.

連接反應條件

1)

評估連接反應結果的方法

i.

瓊脂糖凝膠電泳

ii.大腸桿菌轉化

2)

反應條件

i.

溫度

ii.ATP濃度

iii.時間

iv.連接酶濃度

v.克分子比率DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶

指在

DNA(或

RNA)模板指導下，以4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）為底物，在引物

3’–OH末端聚合DNA鏈的一類酶。

DNA聚合酶在

DNA復制時起關鍵作用。

DNA聚合酶主要有三類：聚合酶Ⅰ（polⅠ），聚合酶Ⅱ(polⅡ)，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其中聚合酶Ⅰ參與DNA修復，聚合酶Ⅲ參與DNA復制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。

DNA聚合酶Ⅰ和

Ⅲ的比較DNA聚合酶的特點：

①

需模板

(DNA或

RNA)；

②

需引物；

③

具有三種酶活性，即

5′→3′聚合酶活性；5′→3′外切酶活性和

3′→5′外切外切酶活性。DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶Ⅰ在DNA復制過程中的作用1、

5′→3′聚合酶活性：

CCGGGCTATCGGE.coli

DNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG2、5′→3′外切酶活性

3、3′→5′外切酶活性

GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli

DNApolIMg2++pC，pT5′TCGATAGCCAGCTATE.coli

DNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5′DNA聚合酶的三種活性DNA的切口平移（nicktranslation）

DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要用途是通過DNA缺口平移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標記的DNA探針。此時，DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’核酸外切酶活性和5’-3’

聚合酶活性同時發(fā)生。5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘-3’外切酶活性5‘-3’聚合酶活性5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘3’5‘↓3’3‘5’未經標記的核苷酸經標記的核苷酸DNA雜交探針的制備5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

********(a)(b)(c)(d)(e)(a)雙鏈的DNA分子(b)帶有3’-OH末端的單鏈缺口(c)polⅠ從5‘-P移去一個核苷酸(d)polⅠ將32P標記的核苷酸參入取代被移去的核苷酸(e)重復(c)(d)的步驟，缺口沿5’-3‘方向移動，形成32P標記的核苷酸合成的DNA鏈探針（probe）

探針：用來探知被測物存在的小

DNA或RNA叫做探針。

標記物：探針上結合有易被檢測的化合物稱為標記物。

分子雜交：探針

DNA或

RNA與被測物的互補結合叫做分子雜交（molecularhybridization）DNA聚合酶Ⅰ

來源

E.coli，由染色體

DNA基因編碼。商品上用的此酶來源于

PhageNM964整合的溶源性

E.coli。

結構

一條多肽鏈，MW=109，000D。

活性

5′→3′聚合，3′→5′和

5′→3′外切。Klenow來源：

E.coliDNAPolymeraseⅠ經蛋白酶水解的大片段

(Klenow

和

Henningseon.1970DNApolⅠ枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶C端

(76kd)+N端（36kd）

Klenow

5’→3’聚合3’→5’外切5’→3’外切Klenow

用途填補限制酶的

5′-粘性末端為平齊末端

5’…CC3’…GGAATT5’…CCTTAA3’

3’…GGAATT5’

Klenow3′-末端標記

Klenow

在無底物時只進行

3′→

5′外切；有底物存在時則聚合。

這種標記也稱作交換標記，但

Klenow

作用不如T4DNA聚合酶。T4DNA聚合酶

來源：T4Phage感染的

E.coli

結構：MW=114,000d

活性：

5′→3′聚合活性；

3′→5′外切活性，對單鏈活性大于雙鏈DNA，外切酶活性比

Klenow

大

200倍

用途

填補或標記限制酶切后產生的

5′-粘性末端的3′-凹缺末端。（同

Klenow）3′-粘性末端的標記制備

DNA探針,同

Klenow

末端標記。

T7DNA聚合酶（測序酶）

來源：T7Phage感染的

E.coli

結構：由

2個蛋白亞基組成：

T7phagegene5蛋白

+宿主硫氧蛋白

活性：

5′→3′聚合，持續(xù)反應時間最長，所以合成的

DNA鏈長。故在

DNA測序中很優(yōu)越。

3′→5′外切，是

DNA聚合酶Ⅰ的

1000倍。用途復制較長的模板，在測序中可讀出較長的序列用填補或交換反應快速進行末端標記。

與

T４DNApol一樣，平齊粘性末端。定點突變中互補鏈的合成。5′3′3′5′修飾的

T7DNA聚合酶(測序酶)

來源：

天然

T７DNA聚合酶經修飾處理

結構：

同T７聚合酶。

用還原劑、分子氧、低濃度

Fe２+與酶保溫幾天，可使PhageT7gene5蛋白

N-端3′→5′外切酶活性中心失活

(O-修飾)。

即：5′→3′聚合酶作用提高，持續(xù)性長。3′→5′外切作用下降

99%以上。

TaqDNA聚合酶(Thermusaqraticus)

來源：從耐熱細胞中純化，已有基因工程酶多種

結構：單亞基

MW=94,000d。

活性：聚合最適溫度為

75-80℃，不具3′→5′外切酶活性，具5′→3′外切活性

。

用途：PCR反應。測序，高溫下進行

DNA合成可減少模板二