硒降低db小鼠血糖李奎

李奎中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所硒降低db小鼠血糖的分子機制研究匯報提綱

課題介紹主要進展成果統(tǒng)計后期計劃經(jīng)費決算課題介紹微量元素硒是動物和人體必需的營養(yǎng)元素，在一些重要的抗氧化酶和含硒蛋白中是必需的組成部分，在體內(nèi)起著平衡氧化還原氛圍的作用硒蛋白基因超家族：GPx、Dio、TrxR、SelP等至少25種硒蛋白課題介紹Osamu等報道在大鼠脂肪細胞中，硒與胰島素一樣可以增強葡萄糖的轉(zhuǎn)運能力，硒和胰島素都能夠刺激與胰島素敏感的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(transporter，GLUT)的活性，從而加速葡萄糖的運輸和降低機體血糖

Theinsulin-likeeffectsofselenateinratadipocytes.J.Biol.Chem.(1990)Clements等報道了在大鼠肌肉組織中，硒能夠增強同化或異化反應(yīng)通道而促進葡萄糖的分解和轉(zhuǎn)運，但不能促進葡萄糖轉(zhuǎn)化成糖原的形式

Insulin-likevs.non-insulinstimulationofglucosemetabolismbyvanadium,tungstenandseleniumcompoundsinratmuscle.LifeSci.(1996)課題介紹糖尿病db小鼠經(jīng)補硒(Selenate，硒酸鈉)處理后，改善了胰島素敏感性，外周組織的胰島素抵抗顯著降低Compendiumoftheantidiabeticeffectsofsupranutritionalselenatedoses.JNutr.Biochem.(2006)STZ(鏈脲佐菌素)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠補硒處理后，其抗氧化酶活性增強，血糖、糖化血紅蛋白、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物均下降，以及引起氧化應(yīng)激的RAGE(糖化終末產(chǎn)物受體)和炎癥反應(yīng)的NFkB也下調(diào)，糖尿病癥狀緩解SeleniumDownregulatesRAGEandNFκBExpressioninDiabeticRats.BiolTraceElemRes.(2012)課題介紹研究證明，硒在糖尿病病理過程中，有降低血糖和調(diào)控胰島素介導(dǎo)的代謝過程等擬胰島素作用，但其具體機制仍不清楚本課題旨在通過基因表達譜芯片掃描、microRNA差異表達及其靶標(biāo)預(yù)測和功能驗證、蛋白質(zhì)譜分析和組織切片分析等技術(shù)，從基因組學(xué)、表觀遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和病理學(xué)等多方面深入探討微量元素硒及其代謝通路參與影響糖脂代謝通路和胰島素信號傳導(dǎo)通路的過程，探索硒緩解糖尿病高血糖癥狀的分子機理課題思路主要內(nèi)容及進展db小鼠模型的灌胃給硒處理及表型指標(biāo)檢測組織病理切片制備與觀察肝臟、胰腺組織轉(zhuǎn)錄組表達譜芯片掃描肝臟組織microRNA芯片掃描和蛋白質(zhì)譜分析綜合分析，預(yù)測可能的代謝機理糖尿病動物模型構(gòu)建db小鼠給硒處理小鼠模型：C57BL/KsJ-db/db，LepR自發(fā)突變

肥胖DM組(db-/-，n=30)、正常NC組(db+/+，n=20)

雄性♂，6周齡硒劑：硒酸納(sodiumselenate，Sigma)水溶液劑量：按小鼠的LD50(~3.5mg/kgBW)的5%~25%劑量給藥每天定時定點灌胃給硒和水，為期9周檢測：每周測一次體重和空腹血糖實驗結(jié)束后采全血，檢測糖化血紅蛋白和血清胰島素

屠宰取胰腺、肝臟組織凍存、固定

db-/-db+/+體重與空腹血糖變化

體重變化基本不受影響DM組給硒處理組FBG顯著下降NC組給硒處理不影響FBG正常值糖化血紅蛋白變化糖化血紅蛋白(HbA1c)可以穩(wěn)定可靠地反映出一段時間的平均血糖水平，且受抽血時間，是否空腹，是否使用胰島素等因素的干擾不大，因此可以很好地反映血糖被控制的情況db小鼠給硒組：血糖控制良好，顯著下降正常小鼠對照組：

血糖正常穩(wěn)定，給硒不影響胰島素變化以DM肥胖小鼠為對照組(DM-C)，根據(jù)血清胰島素變化，把血糖顯著降低的DM硒處理組分成兩組：胰島素升高組(DMSe-H)、胰島素降低組(DMSe-L)可能的機制：

胰島素升高組(H)：改善胰島素合成與分泌，提高血液胰島素水平，降低血糖

胰島素降低組(L)：改善了外周組織的胰島素敏感性，促進血糖的利用，降低血糖DM-CDMSe-LNCDMSe-Hliverpancreas100μm100μm100μm100μm100μm100μm100μm100μmDM對照組（DM-C）胰島細胞與周邊組織界限不清，大小形態(tài)不規(guī)則

肝細胞脂肪變性和空泡化顯著胰島素升高組（DMSe-H）胰島細胞顯著增生，體積增大肝細胞脂肪變性和空泡化顯著胰島素降低組（DMSe-L）胰島細胞與周邊組織界限較清楚肝細胞脂肪變性和空泡化程度降低組織病理學(xué)分析轉(zhuǎn)錄組學(xué)芯片分析轉(zhuǎn)錄組表達譜芯片掃描：

Roche

NimbleGen設(shè)計：

DM-C、DMSe-H、DMSe-L三個組差異基因篩選數(shù)目統(tǒng)計：

肝臟胰腺上調(diào)下調(diào)上調(diào)下調(diào)DMSe-HvsDM-C65393621DMSe-LvsDM-C171400胰島素升高組差異基因參與的細胞代謝通路圖：肝臟細胞氧化還原反應(yīng)脂肪酸合成代謝胰島素升高組差異基因參與的細胞代謝通路圖：胰腺胰島素分泌調(diào)節(jié)和信號通路能量代謝細胞增殖胰島素升高組肝臟和胰腺組織分子機制肝臟組織中，DMSe-H組篩選到Cyp3a16、Cyp3a41b、Cyp2c37、Es1、Serpina1b等細胞氧化還原反應(yīng)的基因下調(diào)表達，Acacb、Agrp、Scd1、Pltp、Aldh1a2等脂肪酸合成代謝相關(guān)的基因顯著上調(diào)表達，表現(xiàn)出氧化應(yīng)激和脂肪酸合成代謝活動增強，脂肪沉積程度增大。表明肝臟組織的胰島素抵抗加劇胰腺組織中，DMSe-H組篩選到Ins1、Ins2、Pdx6、Amy2b、Scgn等參與胰島素分泌調(diào)節(jié)的基因表達上調(diào)，還有Aldh1a3、Ddc、Pde5a、G6pc2等能量代謝酶基因也上調(diào)，表明胰島細胞合成和分泌胰島素的能力增強了，表現(xiàn)在血清胰島素水平升高，具有降低血糖作用胰島素升高組與對照組DM-C相比胰島素降低組差異基因參與的細胞代謝通路圖：肝臟胰島素信號通路糖脂分解代謝胰島素降低組肝臟和胰腺組織分子機制肝臟組織中，

DMSe-L組篩選到IGF2、Pck1基因顯著上調(diào)，參與胰島素信號通路代謝，表明肝臟利用葡萄糖合成糖原能力加強；Txnip、Crispld2等抗氧化酶基因表達上調(diào)，顯示肝臟抗氧化應(yīng)激能力增強；Ugt2b38和Lipa、Mogat2等基因分別是肝糖分解代謝和脂肪酸分解代謝相關(guān)的酶表達下調(diào)，表明肝臟的脂肪沉積程度減弱在胰腺組織中，DMSe-L組未篩選出差異基因，表明胰島細胞分泌胰島素的能力無差異，而降低的胰島素水平可能是因為外周組織對胰島素的敏感性增強，對胰島素的利用率增加胰島素降低組與對照組DM-C相比表型監(jiān)測、組織學(xué)和基因表達分析小結(jié)硒干預(yù)后，血糖得以控制的可能機制推測：胰島素升高組：胰島β細胞大量增殖，胰島素的合成與分泌顯著加強，通過高胰島素促進外周組織對血糖的利用和儲存，從而表現(xiàn)出血糖降低的結(jié)果胰島素降低組：外周組織對胰島素的敏感性得以改善，在較低水平的胰島素作用下，即可實現(xiàn)對血糖的有效利用，表現(xiàn)出降低血糖；由于對胰島素的需求降低，機體未出現(xiàn)高胰島素血癥，胰島未顯著增大表觀遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析蛋白質(zhì)電泳圖，差異蛋白點分析microRNA芯片掃描2-DIGE雙向電泳質(zhì)譜檢測microRNA芯片掃描與蛋白質(zhì)譜檢測microRNA芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-144在DM小鼠喂硒后表達量顯著上調(diào)，通過軟件預(yù)測到其靶標(biāo)之一為Aldh1a3Aldh1a3是乙醛脫氫酶超級家族成員之一，該家族中另外三名成員Aldh2、Aldh4a1和Aldh1L1在DM小鼠喂硒后與NC小鼠喂硒后出現(xiàn)差異表達下調(diào)轉(zhuǎn)錄組分析中，也檢測到Aldh1a2和Aldh1a3差異表達PathwayAldh1a3和Aldh2存在于組氨酸代謝通路中，Aldh2和Aldh4a1同時在精氨酸和脯氨酸代謝通路中起作用幾個蛋白之間有一定的關(guān)系，mir-144能夠通過調(diào)控靶標(biāo)Aldh1a3的表達，進而影響Aldh2

、Aldh4a1和Aldh1l1的表達，從而參與細胞氧化還原過程和調(diào)控機體糖脂代謝，起到預(yù)防和防治糖尿病的作用綜合分析小結(jié)根據(jù)從各方面的研究結(jié)果推測，硒可能通過滲入其硒蛋白的氧化還原作用，增強機體抗氧化能力，清除自由基，修復(fù)胰島細胞和外周組織，使胰島素合成和分泌增加，同時還改善外周組織對胰島素的敏感性，進而增強血糖的利用率，緩解了糖尿病癥狀后期計劃I、微量元素硒可能促進胰島細胞增生增大，并影響胰島素的合成和分泌的體外驗證：體外分離培養(yǎng)胰島細胞，加硒處理，觀察胰島細胞的形態(tài)變化，監(jiān)控胰島素合成和分泌的情況，分子生物學(xué)檢測胰島素信號通路相關(guān)基因和蛋白之間的相互作用及變化，推測可能的作用機理后期計劃II、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)水平均檢測到乙醛脫氫酶的差異表達，表明其與硒存在某種聯(lián)系在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平，檢測GPx等硒蛋白和乙醛脫氫酶的時空表達譜，比較并尋找它們之間可能存在的相互聯(lián)系，并通過體外細胞實驗，探索它們在氧化還原過程中的相互作用機理糖尿病小型豬模型構(gòu)建通過高脂高糖飼料誘導(dǎo)廣西巴馬小型豬，已獲得了具有肥胖、胰島素抵抗、高胰島素血癥、糖耐量受損、患脂肪肝和肝炎癥的2型糖尿病小型豬個體已成功獲得11β-HSD、hIAPP、Chop等單基因或多基因在胰腺組織特異過表達的幾種轉(zhuǎn)基因小鼠個體，并對其進行了全面的表型測定，為轉(zhuǎn)基因糖尿病豬模型的構(gòu)建奠定了研究基礎(chǔ)獲得成果2012年度成果統(tǒng)計發(fā)表論文20余篇，SCI收錄12

篇

新申請專利6項，獲授權(quán)專利6項，其中4項已發(fā)證2012年度國家科技發(fā)明二等獎

作為參加單位獲北京實驗動物行業(yè)協(xié)會獎一等獎代表性論文RenHY,ZhangNB,WangCQ,WangYF,LiK.Selenatepreventstype2diabetesbyregulatingproteinsinvolvedintheoxidation-reductionprocess.JMol.Med.(Contributing)獲得成果ZhangJ,YingZZ,TangZL,LongLQ,LiK.MicroRNA-148apromotesMyogenicdifferentiationbytargetingtheROCK1gene.JBiolChem.2012.Jun.15;287(25):21093-101.(IF:4.773)熒光素酶檢測結(jié)果表明miR-148a可以負調(diào)控ROCK1的3’UTR區(qū)域，表明ROCK1是miR-148a的候選靶標(biāo)基因。miR-148a可在C2C12分化過程中抑制ROCK1的表達。抑制miR-148a的表達后，ROCK1的表達出現(xiàn)上調(diào)。干擾ROCK1的表達，會下調(diào)終末分化基因MHC的表達。證明ROCK1參與骨骼肌細胞的終末分化。獲得成果HouXH,TangZL,LiuHL,WangN,JuHM,LiK.DiscoveryofmicroRNAsassociatedwithmyogenesisbydeepsequencingofserialdevelopmentalskeletalmusclesinpigs.PLOSONE.2012.vol7:e52123.(IF:4.092)miR-378主要在胎兒及出生后骨骼肌生長發(fā)育高峰期高表達，推測miR-378對肌肉的發(fā)育具有重要調(diào)控作用。qPCR結(jié)果表明，除了已報道的肌肉特異性表達miRNA（miR-1與miR-206），miR-378也在肌肉中高表達。獲得成果MaL,YangSL,ZhaoWM,TangZL,ZhangTT,LiK.IdentificationandanalysisofpigchimericmRNAsusingRNAsequencingdata.BMCGenomics.2012.13(1):429.(IF:4.073)轉(zhuǎn)錄組測序揭示嵌合RNA在性別間轉(zhuǎn)錄差異不明顯建立了“親本基因通過轉(zhuǎn)錄工廠共享機制形成嵌合RNA”模型在豬中鑒定了676個嵌合RNA獲得成果LiuN,XiaoB,RenHY,Ta