顯微操作技術(shù)

顯微操作技術(shù)

生命科學(xué)學(xué)院

楊東

QQ1034683507第1章顯微技術(shù)發(fā)展歷史1.1.1生物學(xué)顯微技術(shù)的概念:

是基于生物學(xué)理論知識(shí),以生物體為材料,在光學(xué)顯微鏡觀察的范圍內(nèi)所開(kāi)展進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù).1.1.2顯微鏡的發(fā)明史★十六世紀(jì)的顯微鏡★十七世紀(jì)顯微鏡鏡★十八世紀(jì)的顯微鏡★十九世紀(jì)的顯微鏡★二十世紀(jì)的顯微鏡★未來(lái)的顯微鏡

“昨天，今天和明天”十六世紀(jì)的顯微科學(xué)

十六世紀(jì)單式顯微鏡十六世紀(jì)復(fù)式顯微鏡

第一個(gè)復(fù)式顯微鏡:詹森顯微鏡十七世紀(jì)的顯微科學(xué)

單式顯微鏡的發(fā)展

單式顯微鏡有一個(gè)致命的缺點(diǎn),它的焦距與透鏡直徑成正比,與放大倍數(shù)成反比。也就是說(shuō),焦距越短,放大倍數(shù)越大,而透鏡直徑又越小。如果放大倍數(shù)是100倍,透鏡的焦距為0.25毫米,透鏡直徑大約為0.33毫米。這個(gè)比大頭針頭還小的透鏡在當(dāng)時(shí)根本制造不出來(lái)。因此,當(dāng)時(shí)的放大鏡的放大倍數(shù)最多不過(guò)25倍。列文虎克和他的顯微鏡（約1680）

單式顯微鏡的頂峰----列文虎克的顯微鏡

AntonivanLeeuwenhoek(1632-1723)荷蘭代爾夫特人，是生物學(xué)發(fā)展史上的一位重要人物，一位僅僅受過(guò)初級(jí)教育的天才科學(xué)家和顯微鏡制造者。他一生親自磨制了550個(gè)透鏡，裝配了247架顯微鏡，為人類創(chuàng)造了一批寶貴的財(cái)富，至今保留下來(lái)的有9架。他最先發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌，從而開(kāi)創(chuàng)了微生物學(xué)。

復(fù)式顯微鏡在性能上明顯優(yōu)于單式顯微鏡。一是它的放大率可以做得很高,可以把幾個(gè)放大倍數(shù)較小的凸透鏡組合起來(lái)獲得很高的放大率。二是制造工藝較簡(jiǎn)單,不必磨制一個(gè)個(gè)極小的透鏡。復(fù)式顯微鏡的發(fā)明,是科學(xué)史上的里程碑,人類從此開(kāi)始認(rèn)識(shí)微觀世界。

伽利略的顯微鏡胡克的顯微鏡十八世紀(jì)的顯微科學(xué)

十八世紀(jì)是歐洲科學(xué)復(fù)蘇的時(shí)期,各種新的科學(xué)理論層出不窮。由于不被人十分重視,十八世紀(jì)的復(fù)式顯微鏡發(fā)展很慢,但仍然做出了一些漂亮的顯微鏡。這類顯微鏡的特色在于:

(1)新式底座。

(2)獨(dú)特鏡臂結(jié)構(gòu)。

(3)當(dāng)時(shí)最先進(jìn)的聚光方法。

卡夫(Cuff)顯微鏡

Cuff顯微鏡的功能在當(dāng)時(shí)是最多的.它有三種性能:透射觀察,落射觀察和活體觀察.其中,活體觀察功能是在當(dāng)時(shí)復(fù)式顯微鏡中特有的。

Cuff顯微鏡是當(dāng)時(shí)最好的復(fù)式顯微鏡.

Cuff-Style顯微鏡Wales顯微鏡Chest顯微鏡

歷史上最豪華的顯微鏡:英王GeorgeIII的銀顯微鏡。十九世紀(jì)的顯微科學(xué)

十九世紀(jì)，隨著工業(yè)革命的進(jìn)行，顯微科學(xué)也同其它學(xué)科一起飛速發(fā)展起來(lái)。其主要的原因是機(jī)械的使用使透鏡的質(zhì)量大大提高和光學(xué)的發(fā)展使顯微鏡的結(jié)構(gòu)更加符合光學(xué)原理。Ladd的學(xué)生顯微鏡

英國(guó)人WilliamLadd在1864年制造，采用了當(dāng)時(shí)最先進(jìn)的齒輪調(diào)焦裝置

這個(gè)顯微鏡的鏡臂上多出了一個(gè)在前幾個(gè)世紀(jì)的顯微鏡上都看不到的東西----聚光鏡

十九世紀(jì)的顯微鏡是今天光學(xué)顯微鏡的雛形wenham顯微鏡由英國(guó)倫敦人FrancisWenham在1882年制造。有著當(dāng)時(shí)最為精巧先進(jìn)的齒輪傳動(dòng)系統(tǒng)和齒輪調(diào)焦系統(tǒng),聚光系統(tǒng)還有成像系統(tǒng)。是十九世紀(jì)中性能最好的顯微鏡,也是歷史上最精美的顯微鏡。Nachet偏振光顯微鏡

最早消除色差的顯微鏡之一最早的偏振光顯微鏡之一二十世紀(jì)的顯微科學(xué)

由于人們?cè)谖锢?，?shù)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域取得了非常大的進(jìn)展，顯微鏡的質(zhì)量大大提高。各種新型的顯微鏡也應(yīng)運(yùn)而生。各種新技術(shù)也相繼出現(xiàn)。數(shù)字成像技術(shù)開(kāi)始了用計(jì)算機(jī)來(lái)處理傳送顯微影象的時(shí)代，使人們記錄顯微影象的方式又前進(jìn)了一步。1.明場(chǎng)顯微鏡2.暗場(chǎng)顯微鏡3.相襯顯微鏡4.偏光顯微鏡5.干涉顯微鏡6.紫外顯微鏡7.熒光顯微鏡8.體式顯微鏡熒光顯微鏡

利用強(qiáng)烈的經(jīng)過(guò)慮光器過(guò)濾的激發(fā)光線（紫外光或藍(lán)紫光）激發(fā)標(biāo)本（經(jīng)過(guò)熒光染色或沒(méi)有）產(chǎn)生熒光進(jìn)行觀察的一種顯微鏡。優(yōu)點(diǎn)：成像對(duì)比強(qiáng)烈，色彩鮮艷，分辨率高，可以觀察到一般不可見(jiàn)的物質(zhì)（如DNA等分子）的分布情況等。現(xiàn)廣泛用于免疫熒光技術(shù)和基因芯片技術(shù)。另一種熒光顯微鏡偏光顯微鏡萬(wàn)能研究顯微鏡功能繁多：有明視野，暗視野，相差，偏振，微分干涉，熒光，顯微攝影等等，有的還具有顯微操作的功能。是一種高檔次的顯微鏡。萬(wàn)能研究顯微鏡

laserconfocalscanningmicroscope,LCSM未來(lái)顯微鏡的發(fā)展一、拍得更清晰二、放大倍數(shù)更高三、更為人性化的設(shè)計(jì)四、一體化的顯微鏡五、專門的網(wǎng)絡(luò)化顯微鏡六、光源的革新

一、拍得更清晰顯微鏡廠商為此開(kāi)發(fā)出各種各樣的顯微鏡鏡頭來(lái)消除各種色差和場(chǎng)曲。最近，在顯微鏡上普遍采用了UIS2光學(xué)系統(tǒng)，它充分體現(xiàn)了無(wú)限遠(yuǎn)校正方式的優(yōu)越性。UIS2無(wú)限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)的物鏡具有在寬波長(zhǎng)范圍內(nèi)（由紫外至近紅外區(qū)）具有一致的高透過(guò)率。同時(shí)具有更高的信噪比，不需要額外補(bǔ)償就可以得到更為清晰的圖像。二、放大倍數(shù)更高通常情況下，目鏡的放大倍數(shù)為10倍或者16倍。以40倍物鏡為例，也不過(guò)是放大400倍或者是640倍，如今卻能夠?qū)⒎糯蟊稊?shù)提高到840倍。例如美國(guó)AMG公司開(kāi)發(fā)的倒置顯微鏡，在物鏡下采用了21倍的光學(xué)放大，使得我們能夠通過(guò)40倍的物鏡就可以觀察到放大倍數(shù)更高的圖像了。如果換成100倍的油鏡，就可以通過(guò)顯示器觀察到放大到驚人的2100倍甚至更高的圖像，無(wú)不讓人贊嘆技術(shù)的發(fā)展之快。

三、更為人性化的設(shè)計(jì)

四、一體化的顯微鏡

也許現(xiàn)在我們接觸到的顯微鏡大多是機(jī)械式的，需要手動(dòng)來(lái)調(diào)焦距、調(diào)光源、調(diào)樣品的位置，特別是針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)，出現(xiàn)了大量連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中顯微觀察的要求。為此，各個(gè)顯微鏡廠商設(shè)計(jì)了能夠用于連續(xù)培養(yǎng)顯微觀察的顯微鏡或配件五、專門的網(wǎng)絡(luò)化顯微鏡Nikon公司的Coolscope和Leica公司的DMD108為臨床遠(yuǎn)程病理會(huì)診提供了方便，它們專門為載玻片顯微觀察設(shè)計(jì)，自動(dòng)轉(zhuǎn)換物鏡，自動(dòng)對(duì)焦，得到的圖像可直接通過(guò)網(wǎng)絡(luò)發(fā)送到異地進(jìn)行專家會(huì)診。六、光源的革新

對(duì)于熒光顯微鏡，到現(xiàn)在為止絕大多數(shù)顯微鏡還在使用鹵鎢燈或者是高壓汞燈，一方面這類光源使用壽命短，需要3到4各月更換一次，每次更換后都需要專業(yè)工程師進(jìn)行位置校準(zhǔn)；另外一方面，這類光源的強(qiáng)度會(huì)隨著使用壽命而衰減；還有一方面，這類光源對(duì)于顯微鏡操作來(lái)說(shuō)需要預(yù)熱來(lái)等待光源強(qiáng)度穩(wěn)定，而且光源關(guān)閉后需要等待30分鐘左右才能重啟.

總觀光學(xué)顯微科學(xué)四百多年的歷史,顯微科學(xué)也得到了飛速發(fā)展。我們可以看到,任何一個(gè)學(xué)科的發(fā)展都離不開(kāi)其它學(xué)科的支持。1.2顯微解剖切片機(jī)發(fā)展史“切出精彩”生物切片機(jī)已發(fā)展成為五大系列上百個(gè)品種,即①旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)

、②滑行式切片機(jī)

、③冰凍切片機(jī)、④振動(dòng)切片機(jī)、⑤超薄切片機(jī)。

1.3染色技術(shù)發(fā)展史1.3.1顯微技術(shù)的用具及其方法演進(jìn)載玻片

蓋玻片染色缸1.3.2染色技術(shù)發(fā)展史

天然染料人工染料

單染雙重染色三重染色四重染色

第2章顯微鏡及其附加設(shè)備一．顯微鏡的光學(xué)性能

透鏡是組成顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的最基本的光學(xué)元件，物鏡目鏡及聚光鏡等部件均由單個(gè)和多個(gè)透鏡組成。依其外形的不同，可分為凸透鏡(正透鏡)和凹透鏡(負(fù)透鏡)兩大類。

三．影響成像的關(guān)鍵因素—相差

由于客觀條件，任何光學(xué)系統(tǒng)都不能生成理論上理想的象，各種象差的存在影響了成像質(zhì)量。下面分別簡(jiǎn)要介紹各種相差。

1．色差（Chromaticaberration）

色差是透鏡成像的一個(gè)嚴(yán)重缺陷，發(fā)生在多色光為光源的情況下，單色光不產(chǎn)生色差。白光由紅橙黃綠青藍(lán)紫七種組成，各種光的波長(zhǎng)不同，所以在通過(guò)透鏡時(shí)的折射率也不同，這樣物方一個(gè)點(diǎn)，在象方則可能形成一個(gè)色斑。

色差一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像在任何位置觀察，都帶有色斑或暈環(huán)，使像模糊不清。而放大率色差使像帶有彩色邊緣

色差(Chromaticaberration)P圖示：色差的產(chǎn)生圖示：色差的消除

PP’n1n22.球差(Sphericalaberration)由主軸上某一物點(diǎn)向光學(xué)系統(tǒng)發(fā)出的單色圓錐形光束，經(jīng)該光學(xué)系列折射后，若原光束不同孔徑角的各光線，不能交于主軸上的同一位置，以至在主軸上的理想像平面處，形成一彌散光斑（俗稱模糊圈），則此光學(xué)系統(tǒng)的成像誤差稱為球差。

球差造成的結(jié)果是，一個(gè)點(diǎn)成像后，不在是個(gè)亮點(diǎn)，而是一個(gè)中間亮邊緣逐漸模糊的亮斑。

球差(Sphericalaberration)軸上物點(diǎn)發(fā)出的大孔徑光線不聚焦于一點(diǎn)PP

球差的矯正常利用透鏡組合來(lái)消除，由于凸、凹透鏡的球差是相反的，可選配不同材料的凸凹透鏡膠合起來(lái)給予消除。

3.慧差：

由位于主軸外的某一軸外物點(diǎn)，向光學(xué)系統(tǒng)發(fā)出的單色圓錐形光束，經(jīng)該光學(xué)系列折射后，若在理想像平面處不能結(jié)成清晰點(diǎn)，而是結(jié)成拖著明亮尾巴的慧星形光斑，則此光學(xué)系統(tǒng)的成像誤差稱為慧差?；鄄?Coma)

圖示：慧差的產(chǎn)生靠近光軸的物點(diǎn)發(fā)出的大孔徑光線不聚焦于一點(diǎn)

PXY慧尾形的彌散像圖示：不同大小慧差的照片慧差的校正：

復(fù)合透鏡；

加光闌；不暈點(diǎn)---同時(shí)消除了球差和慧差的一對(duì)共軛點(diǎn)

非球面透鏡；4．像散（Astigmatism）

像散也是影響清晰度的軸外點(diǎn)單色相差。當(dāng)視場(chǎng)很大時(shí)，邊緣上的物點(diǎn)離光軸遠(yuǎn)，光束傾斜大，經(jīng)透鏡后則引起像散。像散使原來(lái)的物點(diǎn)在成象后變成兩個(gè)分離并且相互垂直的短線，在理想象平面上綜合后，形成一個(gè)橢圓形的斑點(diǎn)。像散是通過(guò)復(fù)雜的透鏡組合來(lái)消除。

造成光學(xué)系統(tǒng)出現(xiàn)軸上像散的主要原因有兩個(gè)一是光學(xué)面有較大的偏心，二是光學(xué)面變形。消除方法：通過(guò)復(fù)雜的透鏡組合來(lái)消除5．場(chǎng)曲（Curvatureoffield）

場(chǎng)曲又稱“象場(chǎng)彎曲”。當(dāng)透鏡存在場(chǎng)曲時(shí)，整個(gè)光束的交點(diǎn)不與理想象點(diǎn)重合，雖然在每個(gè)特定點(diǎn)都能得到清晰的象點(diǎn)，但整個(gè)象平面則是一個(gè)曲面。這樣在鏡檢時(shí)不能同時(shí)看清整個(gè)相面，給觀察和照相造成困難。因此研究用顯微鏡的物鏡一般都是平場(chǎng)物鏡，這種物鏡已經(jīng)矯正了場(chǎng)曲。

圖示：場(chǎng)曲的產(chǎn)生物平面對(duì)應(yīng)的子午面、弧矢面、最小彌散圓平面為曲面場(chǎng)曲與像散結(jié)伴而生6．畸變（Distortion）

前面所說(shuō)各種相差除場(chǎng)曲外，都影響象的清晰度?；兪橇硪环N性質(zhì)的相差，光束的同心性不受到破壞。因此，不影響象的清晰度，但使象與原物體比，在形狀上造成失真。畸變(Distortion)物平面 枕形畸變 桶形畸變畸變成像：枕形畸變是由于視場(chǎng)邊緣部分的放大率高于中心部分放大率所引起桶形畸變是由于視場(chǎng)邊緣的放大率比中心部分低所引起的

像差球差象散慧差場(chǎng)曲負(fù)畸變正畸變光學(xué)顯微鏡基本結(jié)構(gòu)：1.照明燈(Lamp)2.聚光器(Condenser)3.載物臺(tái)和切片夾(Mechanicalstageandspecimenretainer)4.推進(jìn)器(Mechanicalstageadjustmentknob)5.物鏡(Objectives)6.粗細(xì)螺旋(Courseandfinefocusknob)7.目鏡(Oculars)8.照相機(jī)等接口(Connectiontocamera,etc.)數(shù)值孔徑N.A（n.sin）數(shù)值孔徑的大小代表了光鏡的會(huì)聚能力。數(shù)值孔徑越高，光鏡的分辨力越大，所呈影像的亮度越強(qiáng)。（一）數(shù)值孔徑

數(shù)值孔徑簡(jiǎn)寫(xiě)：NA，數(shù)值孔徑是決定物鏡性能的非常重要的參數(shù)它是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率（n）和孔徑角（u）半數(shù)的正弦之乘積。用公式表示如下：NA=nsinu/2它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場(chǎng)寬度與工作距離都會(huì)相應(yīng)地變小。它是一個(gè)比物鏡的焦距更加實(shí)用的特性.任何設(shè)計(jì)良好的物鏡孔徑將能夠表示:1.在多遠(yuǎn)的給定焦距可以看清標(biāo)本中的細(xì)微結(jié)構(gòu)2.當(dāng)孔徑充滿時(shí)可以通過(guò)物鏡的光量

孔徑角又稱“鏡口角”，是物鏡光軸上的物體點(diǎn)與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度。孔徑角越大，進(jìn)入物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正比，與焦點(diǎn)的距離成反比。

顯微鏡觀察時(shí)，若想增大NA值，孔徑角是無(wú)法增大的，唯一的辦法是增大介質(zhì)的折射率n值?；谶@一原理，就產(chǎn)生了水浸系物鏡和油浸物鏡，因介質(zhì)的折射率n值大于一，NA值就能大于一。

以空氣為介質(zhì)（干燥系）的物鏡的NA值多在0.05-0.95之間。空氣的折射率為n=1，二孔徑角最大不能超過(guò)180度，否則會(huì)因?yàn)槲镧R工作距離等于零而無(wú)法工作。Sin(180/2)=1，所以空氣介質(zhì)的NA值小于1。用高倍顯微鏡觀察時(shí)，若想增大NA值，孔徑角是無(wú)法進(jìn)一步增大的，唯一的辦法是增大介質(zhì)的折射率n值?；谶@一原理，就產(chǎn)生了水浸物鏡和油浸物鏡，因介質(zhì)的折射率n值大于1，NA值就能大于1。水的折射率為1.333，水浸系物鏡的NA值最大可達(dá)到1.25。香柏油的折射率為1.515左右，因此一般油浸物鏡的數(shù)值孔徑最大值（NA值）為1.4，這個(gè)數(shù)值在理論上和技術(shù)上都達(dá)到了極限。目前，高級(jí)物鏡用折射率高的溴萘作介質(zhì)，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。介質(zhì)空氣水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66數(shù)值孔徑與其他技術(shù)參數(shù)有著密切的關(guān)系，它幾乎決定和影響著其他各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)。它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場(chǎng)寬度與工作距離都會(huì)相應(yīng)地變小。這里必須指出，為了充分發(fā)揮物鏡數(shù)值孔徑的作用，在觀察時(shí)，聚光鏡的NA值應(yīng)等于或略大于物鏡的NA值。

（二）分辨率

顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個(gè)物點(diǎn)的最小間距，又稱“鑒別率”。其計(jì)算公式是：分辨率Z=0.61*λ/N.A

式中為Z最小分辨率距離；為λ光線的波長(zhǎng)；NA為物鏡的數(shù)值徑?？梢?jiàn)物鏡的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長(zhǎng)兩個(gè)因素決定。NA值越大，照明光線波長(zhǎng)越短，則值越小，分辨率就越高.提高分辨率的效果要提高分辨率，即減少值，可采取以下措施（1）降低波長(zhǎng)λ值，使用短波長(zhǎng)光源（2）增加介質(zhì)值以提高NA值（3）增加孔徑角值以提高NA值（4）增加明暗反差（三）放大率

放大率和有效放大率：由于經(jīng)過(guò)物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率Γ應(yīng)該是物鏡放大率β和目鏡放大率Γ1的乘積：Γ=βΓ1顯然，和放大鏡相比，顯微鏡可以具有高得多的放大率，并且通過(guò)調(diào)換不同放大率的物鏡和目鏡，能夠方便地改變顯微鏡的放大率。分辨率和放大倍率是兩個(gè)不同的但又互有聯(lián)系的概念

有關(guān)系式：500NA<1000NA當(dāng)選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時(shí)，顯微鏡不能分清物體的微細(xì)結(jié)構(gòu)，此時(shí)即使過(guò)度地增大放大倍率，得到的也只能是一個(gè)輪廓雖大但細(xì)節(jié)不清的圖像，稱為無(wú)效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨的能力，但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見(jiàn)。所以放大鏡原理為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力，應(yīng)使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。

根據(jù)：總放大率=物距/物鏡焦距×相距（250mm）/目鏡焦距；增大物距—即鏡筒長(zhǎng)度，可以提高放大率，但是鏡筒不能無(wú)限拉長(zhǎng)，通常國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度為160mm。（四）焦深

焦深為焦點(diǎn)深度的簡(jiǎn)稱，即在使用顯微鏡時(shí)，當(dāng)焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)某一物體時(shí)，不僅位于該點(diǎn)平面上的各點(diǎn)都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內(nèi)，也能看得清楚，這個(gè)清楚部分的厚度就是焦深。焦深大,可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層，焦深與其它技術(shù)參數(shù)有以下關(guān)系：

1．焦深與總放大倍數(shù)及物鏡的數(shù)值孔鏡成反比。

2．焦深大，分辨率降低

（五）鏡像亮度

鏡像亮度是指顯微鏡觀察中的圖像明暗程度。一般鏡檢中，鏡像亮度要求使眼鏡既不感到暗淡，又不耀眼為好。顯微鏡的鏡像亮度與放大倍數(shù)有什么關(guān)系？物鏡的NA值大，鏡像的亮度越大，總的放大倍數(shù)越高。焦點(diǎn)深度（六）視場(chǎng)亮度

視場(chǎng)亮度是指顯微鏡所觀察的整個(gè)視場(chǎng)（或視野）明暗程度，視場(chǎng)亮度不僅僅與物鏡，目鏡有關(guān)，也與聚光鏡、視場(chǎng)光闌和光源有關(guān)。在不更換物鏡和目鏡的情況下，視場(chǎng)亮度增大，鏡像亮度也增大。（七）視場(chǎng)直徑

視場(chǎng)直徑也稱視場(chǎng)寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場(chǎng)內(nèi)所能容納被檢物體的實(shí)際范圍。視場(chǎng)直徑23最為科學(xué)，大視場(chǎng)容易引起場(chǎng)曲。F=FN/M;F:視場(chǎng)直徑，F(xiàn)N：視場(chǎng)數(shù)，M:物鏡放大率。視場(chǎng)數(shù)（FieldNumber,簡(jiǎn)寫(xiě)為FN），標(biāo)刻在目鏡的鏡筒外側(cè)。由公式可看出：

1．視場(chǎng)直徑與視場(chǎng)數(shù)成正比。

2．增大物鏡的倍數(shù)，則視場(chǎng)直徑減小。因此，若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很小一部份。

不同目鏡的視場(chǎng)直徑(八)蓋玻片校正

由于蓋玻片的厚度不標(biāo)準(zhǔn)，光線從蓋玻片進(jìn)入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產(chǎn)生了相差，這就是覆蓋差。國(guó)際上規(guī)定，蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為0.17mm，許可范圍在0.16-0.18mm，在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計(jì)算在內(nèi)。物鏡外殼上標(biāo)的0.17，即表明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。(九)工作距離工作距離是指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離.工作距離短,物鏡的孔徑角則大.換而言之,數(shù)值孔徑大的高倍鏡,其工作距離小.焦點(diǎn)：決定圖像是模糊還是清晰？焦點(diǎn)與焦距有關(guān)，且可以通過(guò)聚焦旋鈕控制。樣本載波片上的蓋片厚度也會(huì)影響圖像對(duì)焦??蓋片對(duì)物鏡而言可能太厚。正確的蓋片厚度應(yīng)標(biāo)注在物鏡的側(cè)面。花粉粒對(duì)焦（左圖）和失焦（右圖）時(shí)的顯微鏡圖像分辨率：圖像中的兩個(gè)像素達(dá)到多近的間距時(shí)會(huì)分辨不清？分辨率與物鏡的數(shù)值孔徑（數(shù)值孔徑越大，分辨率越高）以及通過(guò)透鏡的光線波長(zhǎng)（波長(zhǎng)越短，分辨率越好）有關(guān)?；ǚ哿５母叻直媛剩ㄗ髨D）和低分辨率（右圖）顯微鏡圖像調(diào)節(jié)不同參數(shù)產(chǎn)生的效果亮度：表示圖像有多明亮？亮度與照明系統(tǒng)相關(guān)，因而可以通過(guò)改變燈的電壓/電阻器，以及調(diào)節(jié)聚光器和光圈/針孔孔徑進(jìn)行更改。此外，亮度還與物鏡的數(shù)值孔徑有關(guān)（數(shù)值孔徑越大，圖像越明亮）。花粉粒在高亮度（左圖）和低亮度（右圖）情況下的顯微鏡圖像對(duì)比度：樣本周圍區(qū)域的光照差別怎樣？對(duì)比度與照明系統(tǒng)相關(guān)，可以通過(guò)改變光線強(qiáng)度以及光圈/針孔孔徑對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)。除此之外，對(duì)樣本進(jìn)行化學(xué)著色也可以增強(qiáng)對(duì)比度。花粉粒在高對(duì)比度（左）和低對(duì)比度（右）情況下的顯微鏡圖像三.顯微鏡的構(gòu)造

顯微鏡的基本構(gòu)造包括兩大部分,光學(xué)系統(tǒng)和機(jī)械系統(tǒng),機(jī)械系統(tǒng)有鏡座,鏡柱,鏡壁,鏡筒,物鏡轉(zhuǎn)換器,載物臺(tái),調(diào)焦螺旋,聚光器調(diào)節(jié)螺旋.光學(xué)系統(tǒng)有物鏡,目鏡,反光鏡,聚光器,虹彩光圈.1.物鏡

齊焦性能和合軸程度齊焦性能是反映某一倍率的物鏡觀察圖象清晰后,在轉(zhuǎn)換至另一倍率的物鏡時(shí),其成像亦應(yīng)基本清晰,而且物鏡光路也基本合軸,中心不偏離.根據(jù)物鏡前透鏡與被檢物體之間的介質(zhì)不同，可分為：①干燥系物鏡以空氣為介質(zhì)，常用的40×以下的物鏡，數(shù)值孔徑均小于1。②水浸系物鏡③油浸系物鏡根據(jù)物鏡放大率的高低，可分為：①低倍物鏡指1×—6×，NA值為0.04—0.15；②中倍物鏡指6×—25×，NA值為0.15—0.40；③高倍物鏡指25×—63×，NA值為0.35—0.95；④油浸物鏡指90×—100×，NA值為1.25—1.40。

物鏡結(jié)構(gòu)根據(jù)物鏡像差校正的程度來(lái)分類可分為：①消色差物鏡是最常用的物鏡，外殼上標(biāo)有“Ach”字樣，該物鏡可以除紅光和藍(lán)光形成的色差。鏡檢時(shí)通常與惠更斯目鏡配合使用。②復(fù)消色差物鏡物鏡外殼上標(biāo)有“Apo”字樣，除能校正紅、藍(lán)、綠三色光的色差外，還能校正紅、藍(lán)色光造成的球差，通常與補(bǔ)償目鏡配合使用。③半復(fù)消色差物鏡

④平場(chǎng)物鏡是在物鏡的透鏡系統(tǒng)中增加一快半月形的厚透鏡，以達(dá)到校正場(chǎng)曲的缺陷，提高視場(chǎng)邊緣成像質(zhì)量的目的。對(duì)于平視場(chǎng)消色差物鏡，其倍率色差不大，不必用特殊目鏡補(bǔ)償。而平視場(chǎng)復(fù)消色差物鏡，則必須用目鏡來(lái)補(bǔ)償它的倍率色差。⑤特種物鏡在上述物鏡基礎(chǔ)上，為達(dá)到某些特定觀察效果而制造的物鏡。如：帶校正環(huán)物鏡，帶視場(chǎng)光闌物鏡，相差物鏡，熒光物鏡，無(wú)應(yīng)變物鏡，無(wú)罩物鏡，長(zhǎng)工作距離物鏡等。

2.目鏡

目鏡的作用是把物鏡放大了的實(shí)像再放大一次，并把物像映入觀察者的眼中。目鏡的結(jié)構(gòu)較物鏡簡(jiǎn)單，普通光學(xué)顯微鏡的目鏡通常由兩塊透鏡組成，上端的一塊透鏡稱“接目鏡”，下端的透鏡稱“場(chǎng)鏡”。

1.惠更斯目鏡眼點(diǎn)教低3mm2.冉姆斯目鏡眼點(diǎn)較高12mm3.凱爾勒目鏡4.補(bǔ)償目鏡不能與數(shù)值孔徑低于0.65的物鏡配合使用5.平場(chǎng)目鏡

3.聚光鏡聚光鏡又名聚光器，裝在載物臺(tái)的下方。小型的顯微鏡往往無(wú)聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40以上的物鏡時(shí)，則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補(bǔ)光量的不足和適當(dāng)改變從光源射來(lái)的光的性質(zhì)，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。1.集光器的效用收集光源光線并集合將其成束，以增強(qiáng)照明亮度。通常由2-3個(gè)凸透鏡組成，最上面的透鏡面為平面。2.物鏡的有效鏡口率=（物鏡鏡口率+集光器鏡口率）/21、阿貝聚光鏡2、消色差等光程聚光鏡3、搖出式聚光鏡4、極低倍聚光鏡4顯微鏡的照明裝置顯微鏡的照明法按其照明光束的形式，可分為“透射式照明”和“落射式照明”兩大類。透射式照明適用于透明或半透明的被檢物體，絕大多數(shù)生物顯微鏡屬于此類照明法；落射式照明則適用于非透明的被檢物體。透射式照明又可分為中心照明和斜射照明兩種形式。中心照明又分為臨界照明法和柯勒照明法。

5.物鏡4.標(biāo)本平面3.聚光鏡2.聚光透鏡

1.光源

8.二次燈像

7.物鏡

6.標(biāo)本平面5.聚光鏡4.孔徑光闌3.視場(chǎng)光圈2.聚光透鏡1.光源

臨界照明法柯勒照明法落射式照明1.光源2.聚光透鏡3.孔徑光闌4.視場(chǎng)光圈5.聚光透鏡6.半透膜反射鏡7.物鏡8.被檢物體9.至中間像面光路5顯微鏡的幾種附件1.游標(biāo)尺游標(biāo)尺在普通顯微鏡上常標(biāo)刻在載物臺(tái)上的推動(dòng)器上，研究用顯微鏡多標(biāo)刻在載物臺(tái)的縱橫邊緣。它的主要作用是：１）可粗放測(cè)量被檢物的大小或長(zhǎng)度；２）提供被檢標(biāo)本的坐標(biāo)位置。觀察被檢物體時(shí)，如發(fā)現(xiàn)其要點(diǎn)，可將縱、橫座標(biāo)刻度記錄在案，待以后鏡檢時(shí)，只要按所記刻度進(jìn)行觀察，隨即在視場(chǎng)中被找到。2.顯微測(cè)微尺顯微測(cè)微尺是用來(lái)測(cè)量視場(chǎng)中被檢物體的大小、長(zhǎng)短的工具。包括有目鏡測(cè)微尺和測(cè)微臺(tái)尺（也稱鏡臺(tái)測(cè)微尺），用時(shí)必須兩者互相配合，才能完成其測(cè)量功能。3.投影屏和投影目鏡4.共覽裝置左：目鏡測(cè)微尺下：測(cè)微臺(tái)尺0.01mm

生物光學(xué)顯微鏡的種類倒置顯微鏡1倒置顯微鏡的特點(diǎn)1.投射光倒置顯微鏡的光源和聚光器位于載物臺(tái)的上方，照明光源自上方向向下照射；2.物鏡安裝在載物臺(tái)的下方，向上對(duì)焦；3.物鏡、聚光鏡以及其他光學(xué)具組均適用于長(zhǎng)焦距觀察；4.其一般物鏡最大放大率僅限于40X以內(nèi)，這是因?yàn)樵诠鈱W(xué)設(shè)計(jì)中，無(wú)法同時(shí)解決大數(shù)值孔徑和長(zhǎng)工作距離的要求；5.在醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域中適合觀察培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞或浮游于培養(yǎng)液中的細(xì)胞物鏡補(bǔ)償環(huán)的調(diào)節(jié)常常遇到不同厚度的瓶壁影響觀察效果。為了補(bǔ)償這一弊端，倒置顯微鏡的物鏡裝有補(bǔ)償環(huán)。遇到厚度不同瓶壁影響清晰度時(shí)，可調(diào)節(jié)此環(huán)得到最佳反差時(shí)為止。一般具有相差物鏡，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞。2體視顯微鏡（Stereomicroscope）其光學(xué)結(jié)構(gòu)原理是由一個(gè)共用的初級(jí)物鏡，對(duì)物體成像后的兩個(gè)光束被兩組中間物鏡亦稱變焦鏡分開(kāi)，并組成一定的角度稱為體視角（一般為12度--15度），再經(jīng)各自的目鏡成像，它的倍率變化是由改變中間鏡組之間的距離而獲得，利用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行，而是具有一定的夾角，為左右兩眼提供一個(gè)具有立體感的圖像。它實(shí)質(zhì)上是兩個(gè)單鏡筒顯微鏡并列放置，兩個(gè)鏡筒的光軸構(gòu)成相當(dāng)于人們用雙目觀察一個(gè)物體時(shí)所形成的視角，以此形成三維空間的立體視覺(jué)圖像。特點(diǎn)

1．雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行，而是具有一定的夾角—體視角（一般為12度---15度），因此成像具有三維立體感；2．像是直立的，便于操作和解剖，這是由于在目鏡下方的棱鏡把像倒轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)的緣故；3．雖然放大率不如常規(guī)顯微鏡，但其工作距離很長(zhǎng)4．焦深大，便于觀察被檢物體的全層。5．視場(chǎng)直徑大。6.對(duì)觀察體無(wú)需加工制作，直接放入鏡頭下配合照明即可觀察。觀察物要求放大倍率一般不大，在200倍以下，常用的在4X-45X之間，以落照射明為主，也可用透射光觀察透明物體或半透明物體，或觀察物體的輪廓。因物鏡與觀察體距離較大，可進(jìn)行鏡下操作。應(yīng)用于微電子行業(yè)，醫(yī)學(xué)外科等部門。3、暗視野顯微鏡應(yīng)用：微小粒子、細(xì)菌形態(tài)、細(xì)菌記數(shù)，透明標(biāo)本觀察等。(一)原理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

在日常生活中，室內(nèi)飛揚(yáng)的微粒灰塵是不易被看見(jiàn)的，但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射進(jìn)來(lái)，灰塵便粒?？梢?jiàn)了，這是光學(xué)上的丁達(dá)爾現(xiàn)象。暗視野顯微鏡就是利用此原理設(shè)計(jì)的。丁達(dá)爾現(xiàn)象暗視野顯微鏡是在普通光學(xué)顯微鏡中去除明視野集光器，換上一個(gè)暗視野集光器而成。它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)主要是使用中央遮光板或暗視野聚光器，常用的是拋物面聚光器，使光源的中央光束被阻擋,不能由下而上地通過(guò)標(biāo)本進(jìn)入物鏡。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標(biāo)本上。明場(chǎng)普通顯微鏡成像光路圖暗場(chǎng)照明光路圖標(biāo)本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內(nèi)，因而整個(gè)視野是黑暗的。成像特點(diǎn)及優(yōu)缺點(diǎn)在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像,并非物體的本身，所以只能看到物體的存在和運(yùn)動(dòng)，不能辨清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)，只能呈現(xiàn)出物體的輪廓而且比實(shí)物要大。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運(yùn)動(dòng)，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)微粒的運(yùn)動(dòng)等。普通顯微鏡只要聚光器是可以拆卸的，支架的口徑適于安裝暗視野聚光器，即可改裝成暗視野顯微鏡。在無(wú)暗視野聚光器時(shí)，可用厚黑紙片制作一個(gè)中央遮光板，放在普通顯微鏡的聚光器下方的濾光片框上，也能得到暗視野效果。(二)制作中央遮光板

(1)．將顯微鏡聚光器調(diào)到最高位置，用低倍鏡對(duì)好焦距。

(2)．取下目鏡，從鏡筒中觀察并調(diào)節(jié)光闌的大小，使其與鏡筒中所見(jiàn)物鏡的視野相等。

(3)．用厚黑紙剪制中央擋光板。外圈直徑與濾光片框架相同，中央部分的大小與調(diào)節(jié)好的光闌孔徑一樣(可用半透明的小紙片，放在通光孔處聚光鏡鏡面上，紙上顯示的光斑即為光闌的孔徑，再用圓規(guī)量取大小)。

(4)．將中央擋光板放在濾光片框架上，開(kāi)大光闌進(jìn)行樣品觀察。如需使用高倍鏡作暗視野觀察，應(yīng)按高倍鏡對(duì)焦后的視野大小重新制作中央擋光板。（三）使用方法(1)．把暗視野聚光器裝在顯微鏡的聚光器支架上。

(2)．選用強(qiáng)的光源，但又要防止直射光線進(jìn)入物鏡，所以一般用顯微鏡燈照明。

(3)．在聚光器和標(biāo)本片之間要加一滴香柏油，目的是不使照明光線于聚光鏡上面進(jìn)行全反射，達(dá)不到被檢物體，而得不到暗視野照明。

(4)．升降集光器，將集光鏡的焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)被檢物體，即以圓錐光束的頂點(diǎn)照射被檢物。如果聚光器能水平移動(dòng)并附有中心調(diào)節(jié)裝置，則應(yīng)首先進(jìn)行中心調(diào)節(jié)，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴(yán)格位于一直線上。

(5)．選用與聚光器相應(yīng)的物鏡，調(diào)節(jié)焦距，找到所需觀察的物像。(6)．觀察并記錄結(jié)果。要求與注意事項(xiàng)(1)制作標(biāo)本時(shí)所用的載玻片和蓋玻片均應(yīng)清潔干凈，必須使用薄玻片(載玻片厚度約1.O～1.1mm，蓋玻片厚度約0.1mm)，否則會(huì)影響暗視野集光器斜射光焦點(diǎn)的調(diào)節(jié)，如載玻片太厚，焦點(diǎn)只能落在載玻片內(nèi)，就不能看到物像。標(biāo)本也不能過(guò)厚。(2)采用的光源宜強(qiáng)，一般均用強(qiáng)光燈照明。光線暗則物像不清晰。(3)調(diào)節(jié)光源：使光線集中在暗視野集光器上。先用低倍鏡觀察，移動(dòng)暗視野集光器，使其中央的一個(gè)圓圈恰好處在視野的中央。如暗視野集光器已準(zhǔn)確固定好，則可免去這一步驟。(4)先在暗視野的集光器上加香柏油一滴，然后將標(biāo)本放在載物臺(tái)上，把暗視野集光器向上移，使其上的柏木油與標(biāo)本片的底面接觸，中間不能有氣泡存在。暗視野顯微鏡下蒼白密螺旋體4相差顯微鏡原理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)光波有振幅（亮度）、波長(zhǎng)（顏色）及相位(指在某一時(shí)間上光的波動(dòng)所能達(dá)到的位置)的不同。當(dāng)光波遇到物體時(shí)，其波長(zhǎng)(顏色)和振幅(亮度)發(fā)生變化，于是就能看到物體，當(dāng)光波通過(guò)透明的物體時(shí)，雖然物體的內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)會(huì)有厚度和折光率不同的差異，而波長(zhǎng)和振幅則仍然是不會(huì)發(fā)生改變的。因此，就不易看清這些不同的結(jié)構(gòu)。用普通光學(xué)顯微鏡觀察一些活的微生物或其他細(xì)胞等透明物體時(shí)，也就不易分清其內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)。但是，光線通過(guò)厚度不同的透明物體時(shí)，其相位卻會(huì)發(fā)生改變，形成相差。不過(guò)，相差不表現(xiàn)為明暗和顏色的差異，這種微小的變化，人眼是無(wú)法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。我們可以利用光學(xué)的相干干涉原理，可以把相差改變?yōu)檎穹?，這樣就能使透明的、厚度和性質(zhì)不均勻的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)明暗的不同，能夠較清楚地予以區(qū)別。如果這兩條光波射到光屏的同一點(diǎn)上，而且一條光波比另一條光波遲滯了半個(gè)波長(zhǎng)，即兩條光波因位相相反而互相干涉抵消則光線消失，或者相對(duì)振幅相互影響而光線減弱。如果一條光波雖然遲滯了一個(gè)波長(zhǎng),但兩條光波位相相同,則因波的疊加而光線增強(qiáng)-明相差+暗相差相差顯微鏡，能夠通過(guò)其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變成振幅差，即明暗差，可以被我們的感覺(jué)器官所感知。同時(shí)它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細(xì)胞或未染色標(biāo)本。成像光路圖相差顯微鏡的構(gòu)造特點(diǎn)相差顯微鏡的構(gòu)造以普通顯微鏡為基礎(chǔ)，與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡(通常標(biāo)有PH的標(biāo)記)代替普通物鏡，并帶有一個(gè)調(diào)節(jié)合軸用的望遠(yuǎn)鏡。相差環(huán)則是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，放置在光源通路上，使光線只能由環(huán)狀部分通過(guò)，環(huán)狀光圈的大小可由集光鏡的數(shù)值口徑(N.A)來(lái)調(diào)節(jié)。環(huán)狀光圈的大小由不同大小的環(huán)狀孔控制。環(huán)狀光闌的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。其作用是將直射光所形成的像從一些衍射旁像中分出來(lái)。相差環(huán)相差物鏡是在物鏡的后焦點(diǎn)處加一環(huán)狀相板。相板由光學(xué)玻璃制成，安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜，具有改變相位的作用。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。放大倍數(shù)不同的物鏡，其相板也不同。調(diào)軸望遠(yuǎn)鏡：是用來(lái)進(jìn)行合鈾調(diào)節(jié)的。使用不同的相差物鏡時(shí)，應(yīng)配合相應(yīng)的環(huán)狀光圈，并用合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡觀察環(huán)狀光圈和相板，調(diào)節(jié)至環(huán)狀光圈的亮環(huán)與相板的暗環(huán)完全重合。這樣，光線通過(guò)標(biāo)本后，就必須經(jīng)過(guò)相板而發(fā)生相位的改變，造成明暗差異的影像。要使得聚光鏡下面環(huán)狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上，必需調(diào)節(jié)光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合對(duì)齊，才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應(yīng)被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。環(huán)狀光圈、相差物鏡配合與調(diào)節(jié)好之后，其他操作方法與普通光學(xué)顯微鏡相同。使用方法（1）相差裝置的調(diào)換安裝卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可吸收紅色和藍(lán)色光，使波長(zhǎng)范圍小的單色光線進(jìn)行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。再?gòu)霓D(zhuǎn)換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。

（2）調(diào)焦打開(kāi)光源，旋轉(zhuǎn)集光器轉(zhuǎn)盤，將“0”對(duì)準(zhǔn)標(biāo)示孔，使普通聚光器部分進(jìn)入光路。先使用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操作方法進(jìn)行對(duì)光和調(diào)焦。旋轉(zhuǎn)環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應(yīng)，如相差物鏡為40X時(shí)應(yīng)用40X標(biāo)示孔的光闌。（3）合鈾調(diào)整拔出目鏡，插入合鈾望遠(yuǎn)鏡，一邊從望遠(yuǎn)鏡向內(nèi)觀察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉(zhuǎn)動(dòng)望遠(yuǎn)鏡內(nèi)筒使其上升，當(dāng)對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)，此時(shí)可將望遠(yuǎn)鏡固定住。再升降集光器并調(diào)節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與暗環(huán)一致，然后左右前后調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調(diào)節(jié)鈕，使兩環(huán)完全重合。（4）觀察換回目鏡，按常規(guī)要領(lǐng)進(jìn)行觀察。在更換不同倍率的相差物鏡時(shí)，每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌。用途位相顯微鏡是利用樣品中質(zhì)點(diǎn)折射率的不同或質(zhì)點(diǎn)厚度的不等，產(chǎn)生光線的相位差，使新鮮標(biāo)本不必染色就可以看到，而且能夠觀察到活細(xì)胞內(nèi)線粒體及染色體等精細(xì)結(jié)構(gòu)，還可以應(yīng)用于霉菌、細(xì)菌、病毒等更微小活體的研究，進(jìn)行標(biāo)本形態(tài)、數(shù)量、活動(dòng)及分裂、繁殖等生物學(xué)行為觀察，并可進(jìn)行量度與比較。

用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本

相差顯微鏡比普通光鏡多了2個(gè)部件：①在聚光器上增加一個(gè)環(huán)形光闌；②在物鏡后焦面增加一個(gè)相板，相板上有一個(gè)環(huán)形區(qū)，通過(guò)環(huán)形區(qū)的光比從其它區(qū)域透過(guò)的光超前或滯后1／4，這樣就使通過(guò)標(biāo)本不同區(qū)域光波的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?。相差顯微鏡具有兩個(gè)其他顯微鏡所不具有的功能:①將直射的光(視野中背景光)與經(jīng)物體衍射的光分開(kāi);②將大約一半的波長(zhǎng)從相位中除去，使之不能發(fā)生相互作用，從而引起強(qiáng)度的變化。

5熒光顯微鏡(fluorescencemicroscopy)是以紫外線為光源來(lái)激發(fā)生物標(biāo)本中的熒光物質(zhì)，產(chǎn)生能觀察到各種顏色熒光的一種光學(xué)顯微鏡。利用它可研究熒光物質(zhì)在組織和細(xì)胞內(nèi)的分布。

什么是熒光?物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。熒光（Fluorescence）：

自發(fā)熒光：由細(xì)胞本身存在的物質(zhì)經(jīng)紫外線照射后發(fā)出的熒光。誘發(fā)熒光：一些細(xì)胞成分本身經(jīng)紫外線照射后不發(fā)熒光，但用熒光染料（酸性品紅、甲基綠、吖叮橙等熒光色素）進(jìn)行活體染色或固定后切片染色，就能在熒光鏡下看見(jiàn)熒光，這種熒光叫誘發(fā)熒光。熒光素(fluorochrome)是指一類可以吸收激發(fā)光的光能，并能發(fā)射熒光的物質(zhì)．一定的熒光素能和組織（細(xì)胞）的某些成分發(fā)生特異結(jié)合，并在相應(yīng)部位呈現(xiàn)一定的顏色的熒光．熒光顯微鏡的基本構(gòu)造普通熒光顯微鏡的不足使用熒光物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞中的特定成分或結(jié)構(gòu)，不僅圖像與對(duì)比度增強(qiáng)，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長(zhǎng)的紫外光，大大提高了分辯率（δ=0.61λ/NA）。但當(dāng)所觀察的熒光標(biāo)本稍厚時(shí)，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來(lái)自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來(lái)自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛，原因是大多數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu)）。6激光掃描共聚焦顯微鏡焦點(diǎn)模糊

對(duì)于有一定厚度的樣品（大于2微米），一方面，由于在物鏡聚焦平面上下的平面上也有熒光被激發(fā)，焦平面上的熒光圖像將有一定的模糊，這被稱為軸向（Z）干擾；另一方面，感興趣區(qū)域的樣品也會(huì)受到同一焦平面上鄰近區(qū)域所激發(fā)的熒光的干擾，使得圖像的對(duì)比度降低，這被稱為側(cè)向（XY）干擾。LSCM的工作原理

激光掃描共聚焦顯微鏡的主要原理是利用激光器發(fā)出的激光，透過(guò)光源針孔形成點(diǎn)光源,激發(fā)光透過(guò)激發(fā)波長(zhǎng)濾片后到達(dá)分光鏡。由于分光鏡能夠反射波長(zhǎng)較短的激發(fā)光，而透過(guò)波長(zhǎng)較長(zhǎng)的發(fā)射光，所以激發(fā)光在分光鏡處被反射，透過(guò)物鏡，在掃描裝置和控制裝置的控制下在熒光標(biāo)記標(biāo)本的焦平面上逐點(diǎn)掃描。熒光標(biāo)記被激發(fā)出來(lái)的發(fā)射光經(jīng)原來(lái)入射光路直接反向回到分光鏡，透過(guò)分光鏡后再通過(guò)吸收波長(zhǎng)濾片，隨后通過(guò)探測(cè)針孔到達(dá)光電倍增管(PMT)經(jīng)過(guò)信號(hào)處理，在計(jì)算機(jī)顯示屏上形成圖像。

LSCM的主要組成部分照明針孔：使激光經(jīng)過(guò)照明針孔后形成點(diǎn)光源，點(diǎn)光源具有光源方向性強(qiáng)、發(fā)散小、亮度高、高度的空間和時(shí)間相干性以及平面偏振激發(fā)等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。且與探測(cè)器針孔及焦平面形成共聚焦裝置。光束分離器：將樣品激發(fā)熒光與其他非信號(hào)光線分開(kāi)。物鏡焦平面：激光點(diǎn)光源照射物體在焦平面處聚焦，激發(fā)熒光標(biāo)記的樣本發(fā)射熒光，形成焦點(diǎn)光斑。該光斑經(jīng)過(guò)objective,beamsplitter等一系列裝置的處理，分別在illuminatingpinhole及detectorpinhole兩處聚焦。共聚焦的含義由此而來(lái)。探測(cè)器針孔：與beamsplitter作用類似，起到空間濾波器的作用。最大限度的阻礙非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦點(diǎn)斑以外的散射光，以保證探測(cè)器針孔所接受到的熒光信號(hào)全部來(lái)自于樣品光斑焦點(diǎn)位置，因此樣品上衍射聚集光斑和探測(cè)器針孔成像光斑包含相同信息（兩點(diǎn)共軛）。PMT：光電倍增管（探測(cè)器）：接受通過(guò)針孔的光信號(hào)，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，在屏幕上出現(xiàn)清晰的整幅焦平面的圖象。激光器：共聚焦顯微鏡技術(shù)的發(fā)展離不開(kāi)激光器的飛速發(fā)展。我們可以根據(jù)研究需要選擇不同的激光器。多熒光通道：具有多個(gè)熒光通道，以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行多種標(biāo)記。LSCM與熒光顯微鏡不同之處在此過(guò)程中,由于激光光源的光源針孔和探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的,即所謂的“共聚焦”，樣品焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于光柵針孔和探測(cè)針孔，即只有焦平面上的光才能穿過(guò)探測(cè)針孔，焦平面以外區(qū)域射來(lái)的光線在檢測(cè)小孔平面是離焦的不能通過(guò)小孔，因此，對(duì)樣品進(jìn)行掃描時(shí)，掃描點(diǎn)以外的非觀察點(diǎn)不會(huì)成像，背景呈黑色，樣品需經(jīng)逐點(diǎn)掃描后才形成整個(gè)標(biāo)本的光學(xué)切片。激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn):1.點(diǎn)照明，激光光源2.具有照明小孔和探測(cè)小孔3.照明小孔和探測(cè)小孔共軛(共焦),共焦點(diǎn)即被探測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面4.具有掃描系統(tǒng)——逐點(diǎn)掃描成像5.無(wú)損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”6.真正的三維重組7.具有多個(gè)（四個(gè)）熒光通道，可同時(shí)探測(cè)多個(gè)被標(biāo)記物第二章光鏡標(biāo)本基本制作技術(shù)

生物顯微制片有許多不同的方法，一般可分為非切片法與切片法兩大類顯微制片技術(shù)雖是生物學(xué)中很基本的操作技術(shù)，但由于生物材料的個(gè)體差異，化學(xué)試劑的多樣性，因此操作技術(shù)相當(dāng)細(xì)致而復(fù)雜，方法也很多，每一步驟的失誤都可導(dǎo)致整體的失敗，因此需要耐心細(xì)致，不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，才能得到較好的結(jié)果。1非切片法

即不用切片機(jī)，不經(jīng)切片手續(xù)而制成切片的方法，根據(jù)材料性質(zhì)的不同，有不同的處理方法，該類方法操作簡(jiǎn)單快捷，其中鋪片法，封藏法可使原有組織結(jié)構(gòu)不被破壞，涂片法，壓片法彌補(bǔ)了用包埋，切片法所不可能觀察清楚的不足，因此是顯微標(biāo)本制備的中常用的手段。非切片法有涂片、鋪片、壓片、磨片、離析法等1涂片法主要用于血液、尿液、微生物等不能切片成薄片的液態(tài)顆粒性材料，可在載玻片上涂成單層細(xì)胞，再經(jīng)固定，脫水，染色等手段制成永久標(biāo)本。2鋪片法主要用于動(dòng)、植物組織的表皮層觀察，可活體取待觀察動(dòng)、植物組織，用尖鑷子撕去一層表皮，迅速平鋪在載玻片上。如:洋蔥表皮細(xì)胞的鋪片制備。

3壓片法一些較幼嫩，柔軟的材料可將其置載玻片上，用小解剖刀將其分散，加染料一滴，再蓋上蓋玻片，用拇指垂直用力擠壓，使組織散成一薄片，再進(jìn)行觀察，如植物根尖觀察染色體，花粉粒觀察發(fā)育階段等。4離析法該方法是利用化學(xué)試劑使組織的細(xì)胞間質(zhì)溶解，使細(xì)胞能分散成單個(gè)個(gè)體。經(jīng)染色，脫水，透明即可觀察其個(gè)體形態(tài)，適用于肌肉，葉片，莖等部位。5磨片用于很堅(jiān)硬的組織，如骨和牙。2切片法

切片法是必須依靠手或切片機(jī)將組織切成薄片來(lái)進(jìn)行觀察的方法，根據(jù)所用支持劑的種類不同，可分為徒手切片法，石蠟切片法，火棉膠切法，冰凍切片法等類型，切成薄片后還需要去蠟，染色，脫水，透明等步驟，將其制成永久標(biāo)本。

2.1取材根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇相應(yīng)的材料，材料要求新鮮、準(zhǔn)確、完整，材料要避免擠壓、挫傷、干枯。一般組織學(xué)取材稍大，細(xì)胞學(xué)取材稍小，植物組織取材稍小，動(dòng)物組織取材要稍大。

2.1.1動(dòng)物的麻醉和殺死

從活的動(dòng)物體上采取材料不象采集植物材料那么容易，因?yàn)樵诓皇┘勇樽淼那闆r下，有的動(dòng)物會(huì)收縮(如蚯蚓、水蛭)，有的會(huì)騷動(dòng)(如蛙、鼠)，使我們無(wú)法下手。但制片所需的材料又要求越新鮮越好，尤其是細(xì)胞學(xué)方面的研究對(duì)材料的新鮮程度要求更嚴(yán)。因此，要割取生活著的動(dòng)物組織，在一般情況下，就要對(duì)動(dòng)物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉藥品，必須以不影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)為原則。

若是一般的組織學(xué)制片，要求不太嚴(yán)格的話則可將動(dòng)物先殺死然后速取其組織進(jìn)行固定。蛙、蟾蜍、鼠等較小的動(dòng)物，可用斷頭法殺死，即用普通剪刀剪斷頸部。較大的動(dòng)物，如大竺鼠、免、貓等可用木槌猛擊頭后部，使其昏倒，或用50m1的注射器從耳靜脈向心臟注入空氣，使動(dòng)物發(fā)生急性空氣栓塞痙攣而死。取材注意事項(xiàng)1材料保持新鮮2組織塊免受擠壓3組織塊力求小而薄4盡量保持組織原有形態(tài)5選取好組織塊切面6選擇動(dòng)物品種和熟悉取材的解剖部位7切除不需要的部分8保持材料的清潔

2.2固定割取組織塊后，應(yīng)立即進(jìn)行固定。固定是制片極為關(guān)鍵的一個(gè)步驟，制片質(zhì)量的優(yōu)劣。除與材料的新鮮程度有關(guān)外，還取決于最初的固定是否適當(dāng)和完全。

2.2.1固定的意義

新鮮的組織被割取后,由于細(xì)胞內(nèi)酶的作用和細(xì)菌的繁殖，可引起組織的自溶和腐敗。因此，割取組織塊后，應(yīng)立即采用一種方法．將組織盡可能保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且有利于保存和適于制片的操作，這一步驟稱為固定。固定的目的和作用在于：①使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、糖、脂肪等各種成分沉淀保存下來(lái),防止組織自溶和腐敗,從而保存細(xì)胞的各種組成成分使其保持與生活時(shí)相近似的形態(tài)和結(jié)構(gòu)；②因沉淀及凝固的關(guān)系，使細(xì)胞內(nèi)不同的成分產(chǎn)生不同的折光率，造成光學(xué)上的差別使原來(lái)在生活情況下看不清楚的結(jié)構(gòu)變得清晰易見(jiàn)，且有的固定劑還有助染作用(如醋酸、苦味酸)，從而使細(xì)胞各部易于染色；③固定劑還兼有硬化作用，使柔軟組織硬化不易變形，有利操作。

2.2.2固定的方法

固定有物理方法和化學(xué)方法兩種。物理方法固定有干燥、高熱和低溫驟冷等。例如，血液涂片就是干燥固定；細(xì)菌涂片可用加熱法固定；許多組織化學(xué)反應(yīng)的制片是以低溫驟冷固定作冰凍切片的?；瘜W(xué)方法固定就是用化學(xué)試劑配制成固定液使之固定。

固定注意事項(xiàng)及影響因素1固定組織塊不宜過(guò)大,以便固定液迅速滲透2軟組織或較大塊的組織可先經(jīng)2-3小時(shí)的固定,然后修整成小塊再重新投入新配制的固定液中繼續(xù)固定3固定液的量是組織塊大小的5-20倍為宜4固定時(shí)間的長(zhǎng)短視固定劑的種類,氣溫,組織塊的大小而定

2.2.3固定液的選擇固定液的種類很多?？煞譃閮纱箢悾汉?jiǎn)單固定液和混合固定液。簡(jiǎn)單固定液又稱單純固定液，就是用一種化學(xué)試劑作為固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它們只是對(duì)細(xì)胞的某種成分固定得較好；不能將細(xì)胞所有的成分都保存下來(lái)?；旌瞎潭ㄒ壕褪怯脦追N化學(xué)藥品，按一定的比例混合配制而成，由于各種藥品的優(yōu)缺點(diǎn)互相彌補(bǔ)，因此可產(chǎn)生較好的效果。（3）按固定的方式將固定液分為兩類：凝結(jié)型固定液：使蛋白質(zhì)凝固，形成懸浮顆粒網(wǎng)狀混合液。非凝結(jié)型固定液：不使蛋白質(zhì)凝固，形成透明的凝膠。Ⅰ凝結(jié)型固定液：a酒精(alcohol)：70%-75%酒精滲透力最強(qiáng)。特點(diǎn)：①穿透速度快。②可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，前兩者所生成的沉淀不溶于水，核蛋白所生成的沉淀溶于水；所以經(jīng)乙醇固定的標(biāo)本對(duì)核的染色不良，不適于對(duì)染色體的固定。③濃度50%以上的酒精可溶解脂肪和類脂體。不能用于膜結(jié)構(gòu)的研究，溶解血色素，破壞其他多種色素。④使糖原沉淀，但能溶于水。⑤是還原劑，在混合固定液中，酒精不能與氧化固定液混用。如鉻酸、鋨酸、重鉻酸鉀等。⑥使材料硬化、組織收縮明顯。固定材料適宜濃度為70%-100%。不需沖洗，70%的酒精可較長(zhǎng)時(shí)間保存，若長(zhǎng)期保存材料與甘油等量混合后使用。b醋酸（aceticacid）特點(diǎn)：①穿透力速度極快。②能固定核蛋白，對(duì)胞質(zhì)也存在固定作用。對(duì)核蛋白是凝結(jié)型固定液，對(duì)胞質(zhì)是非凝結(jié)型固定液。使染色質(zhì)和染色體的固定和染色均很好，因此所有固定染色體的固定液中幾乎都有醋酸。③對(duì)脂類和糖類無(wú)固定作用。④對(duì)材料不但不硬化還有軟化作用。對(duì)細(xì)胞無(wú)收縮作用，稍有膨脹作用。⑤不需沖洗，可投入70%的酒精中保存。固定材料適宜濃度為0.3%-5%。C鉻酸（chromicacid）特點(diǎn)：①穿透速度緩慢。②能沉淀所有蛋白質(zhì)，凝固核酸，增強(qiáng)核的著色能力，能固定高爾基體及線粒體。常用于細(xì)胞學(xué)觀察。③對(duì)脂類無(wú)影響；固定糖原，使之不溶于水。④氧化劑，不能與酒精混用。必須用流水沖洗，直至組織中不含鉻酸為止，如沖洗不干凈或直接投入酒精中，被還原成綠色的氧化鉻并發(fā)生沉淀，使染色困難。⑤使組織硬化，細(xì)胞收縮。⑥鉻酸常配成2%或10%的水溶液作為儲(chǔ)備液，固定適宜濃度為0.5%-1%。d苦味酸三硝基苯酚，不能結(jié)晶保存，要以飽和溶液存放。干燥時(shí)易爆炸。特點(diǎn)：①穿透速度中等。②可沉淀一切蛋白質(zhì)。對(duì)脂類無(wú)影響，對(duì)糖類無(wú)固定作用。③細(xì)胞收縮明顯，材料硬化程度很小。④不需沖洗，可直接投入70%酒精中洗去黃色。⑤固定材料適宜濃度為飽和溶液，即0.9%-1.2%。Ⅱ非凝結(jié)型固定液：（質(zhì)量較好）A鋨酸（OsO4）特點(diǎn)：a穿透速度很慢。材料要切的小一些，約1mm3。b不沉淀蛋白質(zhì)，能使蛋白質(zhì)被均勻固定，所以用鋨酸固定的蛋白質(zhì)能保持生活時(shí)的均勻性。c是脂肪和類脂類的很好的固定劑

。d強(qiáng)氧化劑，易揮發(fā)，毒性大。e不使細(xì)胞收縮，對(duì)細(xì)胞質(zhì)固定好。固定物組織柔軟。f流水沖洗12～24小時(shí)。使其完全洗凈，否則遇乙醇就發(fā)生沉淀。g固定材料適宜濃度為0.5-2%。B甲醛：（不用于電鏡制片）特點(diǎn)：a穿透速度快。b可與蛋白質(zhì)化合形成不溶性的化合物而固定，固定脂肪和類脂類化合物。c還原劑，不能與氧化劑混用。d組織硬化程度顯著，收縮小，但經(jīng)酒精脫水后，收縮顯著。e不需水洗，可直接投入70%的酒精。但經(jīng)長(zhǎng)期固定的材料，需經(jīng)流水沖洗1-2天，否則影響染色。f市售的為37-40%甲醛，稱為福爾馬林，固定和保存材料的適宜濃度是10%福爾馬林。

Ⅲ混合固定液：A卡諾(Carnoy)氏固定液：配方：酒精：冰醋酸:氯仿=6:1:3此液適于固定一般動(dòng)物組織和肝糖原以及植物組織。（多用于細(xì)胞學(xué)研究）穿透速度快，為防止組織硬化，固定時(shí)間不要超過(guò)24小時(shí)。時(shí)間以材料的不同而有所區(qū)別，根尖15min,花藥1小時(shí),糖原在3-5℃下固定,小白鼠睪丸30-50min。固定后可轉(zhuǎn)入70%中保存，可直接經(jīng)95%酒精，純酒精脫水。Bouin液配方：飽和苦味酸水溶液:37％－40％甲醛液:冰醋酸＝15:5:1其中冰醋酸能固定染色質(zhì),苦味酸能使組織適當(dāng)硬化,甲醛液可調(diào)節(jié)另兩種試劑對(duì)組織的膨脹作用.因此,此混合液對(duì)組織收縮或膨脹的作用較小,并滲透力強(qiáng),固定均勻,適合絕大多數(shù)器官及組織的固定,能顯示出組織的細(xì)微結(jié)構(gòu),而且染色效果良好,尤其是細(xì)胞核的著色.

Zenker固定液：配方:升汞5.0g

重鉻酸鉀2.5g

蒸餾水(加至)100ml臨用前加入冰醋酸.經(jīng)此液固定的標(biāo)本，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色頗為清晰，但成本較昂貴且需特殊處理汞。該固定液要避免接觸陽(yáng)光，以免引起化學(xué)變化而失效。

(4)固定時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題：①固定的材料越新鮮越好，立即固定。②材料與固定液比例一般為1：20。③根據(jù)材料的性質(zhì)和制片的目的選擇固定液。④有時(shí)要用蔗糖、氯化鈉來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓。⑤材料外表有毛或其他不易穿透的物質(zhì)存在，可先在含酒精的固定液中固定幾分鐘，再換用含水的固定液。⑥含有氣體的材料投入固定液后，不下沉，須將氣體抽出。方法可采用真空泵，或用注射器的簡(jiǎn)易方法。⑦材料固定后一定要做標(biāo)記。3.沖洗：(1)目的：所謂洗滌，即用洗滌劑滲透到材料中，把固定劑洗掉，洗滌必須徹底，才能進(jìn)行下一步操作。否則留在組織中的固定液有的防礙染色，有的會(huì)發(fā)生沉淀物或結(jié)晶而影響觀察，有的可以繼續(xù)發(fā)生作用，破壞材料或影響以后的處理。(2)洗滌的原則與方法：常用的洗滌劑是水和低濃度的乙醇。①固定液用水配的，就用水或流水來(lái)沖洗；不需流水沖洗的材料，放在小瓶?jī)?nèi)，換數(shù)次水，每次1-2小時(shí)。②用各種濃度的酒精配的，就要用與固定液相近濃度的酒精沖洗；材料：酒精=1：10。③用福爾馬林固定的不用水洗，但長(zhǎng)期固定的，應(yīng)充分水洗，否則影響染色。④用鉻酸、重鉻酸鉀等固定的材料就用流水沖洗。沖洗時(shí)間應(yīng)和固定時(shí)間相同或再長(zhǎng)。

4.脫水：

就是用一種溶劑把材料中的水份全部代替干凈。(1)脫水原因：在制作永久制片時(shí)，組織沖洗完畢后必須進(jìn)行脫水，因組織固定和水洗后含大量水分，而水不能和石蠟包埋劑混合，組織內(nèi)只要有極少量水份，就會(huì)防礙包埋劑的滲入。(2)脫水的結(jié)果：使材料變硬，形狀更加穩(wěn)定，利于組織永久保存。除盡材料的水份，才能使透明劑、包埋劑、封藏劑滲透到組織中，有利于組織的透明和浸蠟。(3)脫水劑應(yīng)具備的兩個(gè)特性：①必須是親水性，能與水以任何比例混合，代替細(xì)胞中的水份。②必須能和其他有機(jī)溶劑混溶取代。

(4)脫水的方法：脫水應(yīng)逐步進(jìn)行，而不能驟然進(jìn)行，否則會(huì)引起組織的強(qiáng)烈收縮，或使材料變形。一般把脫水劑配成各種濃度，材料自低濃度到高濃度依次經(jīng)各級(jí)脫水劑，其中所含水份逐漸被脫水劑取代。(5)脫水劑分為兩類：

①非石蠟溶劑的脫水劑：如乙醇、丙酮等，組織脫水后必須經(jīng)二甲苯透明才可浸蠟。②石蠟溶劑的脫水劑：如正丁醇等，組織脫水后即可直接浸蠟，不需經(jīng)過(guò)中間溶劑二甲苯之類的藥品。(6)常用的脫水劑：乙醇：按濃度梯度依次進(jìn)行35%→50%→70%→83%→95%→100%→100%；在各級(jí)停留的時(shí)間根據(jù)材料而定，體積為2mm3的一般每級(jí)為1-4小時(shí)；在低濃度酒精中，每級(jí)停留的時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，否則易使組織變軟，助長(zhǎng)材料解體。從95%到100%乙醇后，時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則材料變硬變脆，影響切片。為使乙醇脫水徹底，應(yīng)更換兩次100%乙醇。如需過(guò)夜應(yīng)停留在70%酒精中。脫水時(shí)的注意事項(xiàng)：a脫水必須要在有瓶蓋內(nèi)進(jìn)行，尤其是高濃度乙醇很容易吸收空氣中的水份。b組織由低濃度向高濃度的乙醇轉(zhuǎn)移時(shí)，要用吸水紙吸干余液，以免將水份帶入。C組織脫水要徹底.純乙醇中如有水，可加無(wú)水硫酸銅以吸去水份。注：在每級(jí)中停留的時(shí)間，依照材料的大小、性質(zhì)以及留在固定液中的時(shí)間長(zhǎng)短和固定液的溶解性而定。5.透明：材料經(jīng)脫水劑去水分后，還要經(jīng)過(guò)一種既能與脫水劑，又能與包埋劑相混合的溶劑—透明劑來(lái)處理，以便于包埋劑的滲入或封藏。在制片過(guò)程中有兩次透明：第一次是組織塊的透明，為了引入包埋劑；第二次是染色以后切片的透明，為了引入封藏劑。常用透明劑：透明劑都是石蠟的溶劑，絕大多數(shù)不能與水混合，最常用的透明劑有二甲苯,苯a二甲苯：目前應(yīng)用最廣。易溶于乙醇，又能夠溶解石蠟，加拿大樹(shù)膠，透明力強(qiáng)，作用較快。其最大缺點(diǎn)是容易變硬變脆，材料必須脫盡水分再透明，否則發(fā)生乳狀渾濁。在材料進(jìn)入二甲苯前，為了減少材料收縮，材料須經(jīng)過(guò)1/2二甲苯+1/2無(wú)水乙醇→二甲苯（I）→二甲苯（II）→1/2二甲苯+1/2石蠟→純石蠟材料在二甲苯中時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則材料收縮變硬、變脆。一般組織塊透明總時(shí)間3-4小時(shí)（每級(jí)60-120分鐘），染色后的切片透明每級(jí)5-10分鐘。

6.浸蠟與包埋：

組織經(jīng)過(guò)透明后要讓石蠟支持劑透入細(xì)胞內(nèi)部使它變硬，并將組織包埋進(jìn)去，把軟組織變?yōu)檫m當(dāng)硬度的蠟塊，以便切成薄片。以利于切片和觀察，這個(gè)過(guò)程稱為“浸蠟”和“包埋”。

(1)石蠟的熔點(diǎn)多為50-60℃。選用不同熔點(diǎn)的石蠟的原則：①石蠟硬度與組織硬度相近似，組織較硬時(shí)，用硬的石蠟，反之用軟的石蠟。一般動(dòng)物材料石蠟的熔點(diǎn)為52-56℃，植物材料石蠟的熔點(diǎn)為54-58℃。②切片較薄時(shí)（4um以下），石蠟的熔點(diǎn)為58-60℃。③最重要的要看室內(nèi)溫度，通常在夏天用熔點(diǎn)高的石蠟（硬蠟），冬天用熔點(diǎn)低的石蠟（軟蠟）。石蠟太硬，切片時(shí)容易破碎，不易切成蠟帶，太軟時(shí)，蠟帶容易皺縮。

(2)浸蠟：

材料經(jīng)透明后，倒入二甲苯，再在上面倒入60℃的石蠟，使石蠟：二甲苯=3：2；放在35-37℃的恒溫箱中浸蠟1-2天。后將溫箱升至60℃，將石蠟和二甲苯倒出，換純石蠟兩次，每次40分鐘至1小時(shí)。在

60℃溫箱中最多放5-6小時(shí)。動(dòng)物材料在透明劑與石蠟等量混合液中15-30分鐘，再換純石蠟兩次，每次1-1.5小時(shí)。浸蠟注意事項(xiàng)

1盡量保持在較低的溫度中,以石蠟不凝固為度2力求在最短限度時(shí)間內(nèi)完成石蠟透入的過(guò)程.溫度過(guò)高,或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)引起組織變硬,變脆,收縮等,影響結(jié)果3浸蠟用的石蠟要定期更換,以保持純度（3）包埋：

組織被石蠟透入達(dá)到飽和的程度后,就需要進(jìn)行包埋.所謂包埋就是被石蠟浸透的組織連同熔化的石蠟,一起倒入一定形的容器內(nèi)(如紙盒)內(nèi),并立即投入冷水中,使它立即凝固成蠟塊的過(guò)程.

步驟：紙盒放于燙板上，將石蠟和材料一起倒出，用加溫后的解剖針將材料調(diào)到合適的位置，標(biāo)簽有文字的一面向下。再補(bǔ)足石蠟。輕輕提起紙盒的兩側(cè)的把手，慢慢平放于盆的水面上，待紙盒內(nèi)石蠟表面已凝固，即可將紙盒向一側(cè)傾斜，使其立即進(jìn)入冷水中，迅速凝固，經(jīng)30min-1h后，取出晾干。包埋中出現(xiàn)的問(wèn)題及解決辦法問(wèn)題:包埋后的石蠟塊應(yīng)為均勻的半透明狀態(tài),但是有時(shí)候出現(xiàn)白色渾濁的結(jié)晶部分,這樣在切片時(shí)就有妨礙原因:1脫水不干凈2組織內(nèi)部或石蠟中混有透明劑3石蠟本身品質(zhì)不良4組織塊倒如紙盒時(shí),周圍的石蠟已成凝固狀態(tài)5石蠟冷凝得太慢7.切片：

石蠟切片，用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)。一個(gè)旋轉(zhuǎn)切片機(jī)，可分三個(gè)部分，一個(gè)是安裝切片刀的部分，有調(diào)節(jié)刀片斜度和固著刀片的螺旋。一個(gè)是安裝材料的部分，也有螺旋可以調(diào)節(jié)材料的位置。另一個(gè)是操縱在旋轉(zhuǎn)中向前推進(jìn)的部分，控制著切片的厚薄，是比較重要而復(fù)雜的部分。8.貼片：貼附牢固，在染色時(shí)不易脫落；使皺褶的蠟片伸展平整。用具：載玻片、粘片劑、解剖刀、蒸餾水、展片機(jī)及銬片機(jī)。A將展片機(jī)溫度調(diào)整到42℃，保持恒定。B在載玻片上涂蛋白甘油等粘片劑。C將涂粘片劑的載玻片放在展片機(jī)上，滴加蒸餾水?dāng)?shù)滴，此時(shí)若發(fā)現(xiàn)水不均勻分散而聚成滴狀，即表示玻片不清潔，有殘留油脂等物在上面。D用解剖刀將蠟帶切成小段，每段的長(zhǎng)度應(yīng)以蓋玻片的長(zhǎng)度為準(zhǔn)，一般應(yīng)比蓋玻片短約1/5-2/5。分片應(yīng)從蠟帶交界處分。F將蠟帶輕輕移到涂有水的載玻片上，蠟片光面應(yīng)向下貼在載玻片上，依次排列整齊。留出右端貼標(biāo)簽處。G材料展平后，從展片機(jī)上取下，稍稍傾斜留出多余的水分，用吸水紙吸干背面及周圍多余水分，放于烤片機(jī)（42℃）上烤干水分。切片的方法主要有（ABCD）A石蠟切片法B冰凍切片法C塑料包埋切片法D半超薄切片法E整體封藏法F分離法

石蠟切片術(shù)中用于固定的組織塊大小一般為(

C

)

A.1.0mm左右

B.1.0cm左右

C.5.0mm左右

D.5.0cm左右在病理組織制片過(guò)程中,取材的要求一般為：(ABCE)A.一般厚度0.2-0.3cm

B.大小0.2~0.3×1.5×1.5cmC.免疫組化染色用組織以1×1×0.2cm為好D.冰凍切片組織塊可厚至0.3-0.4cmE.特殊需要也可大于以上大小組織固定的意義是（）A.使蛋白質(zhì)迅速溶解B.防止細(xì)胞自溶C.使組織膨脹D.使組織堅(jiān)硬E.防止組織腐組織固定時(shí)所使用的固定液的量一般為()A2倍B4倍C8倍D10-15倍下列物質(zhì)那些能固定蛋白質(zhì)（）A乙醇B苦味酸C醋酸D鉻酸E重鉻酸鉀F福爾馬林即能固定白蛋白又能固定核蛋白的物質(zhì)是（）A乙醇B醋酸C福爾馬林D鉻酸E苦味酸 F重鉻酸鉀固定高爾基體和線粒體的固定劑可選（）A乙醇B福爾馬林C醋酸D苦味酸E重鉻酸鉀固定劑乙醇可以與那些物質(zhì)混合使用（）A福爾馬林B醋酸C鉻酸D鋨酸E升汞固定速度最慢的物質(zhì)是（）A乙醇B福爾馬林C醋酸D苦味酸固定后不會(huì)發(fā)生組織收縮的物質(zhì)有（）A乙醇B福爾馬林C醋酸D苦味酸E重鉻酸鉀F鉻酸甲醛屬于常用的單純組織固定液，對(duì)其描述下面錯(cuò)誤的是()A．相對(duì)而言，甲醛水溶液滲透能力強(qiáng)組織固定均勻B．甲醛價(jià)格較低，可用于固定和保存大體標(biāo)本C．長(zhǎng)時(shí)間固定的標(biāo)本，形成的甲醛色素沉積無(wú)法去除，故而組織固定不能時(shí)間過(guò)長(zhǎng)D．長(zhǎng)時(shí)間固定的標(biāo)本，形成甲醛色素沉積可用乙醇配氨水去除E．甲醛固定能保持脂類和類脂類對(duì)于重鉻酸鉀固定劑，對(duì)其描述下面錯(cuò)誤的是A．重鉻酸鉀為橙紅色晶體，有毒B．用于固定高爾基體和線粒體效果較好C．組織穿透速度快D．重鉻酸鉀固定的組織明顯收縮E．重鉻酸鉀固定的組織，酸性染料著色良好那些固定劑固定后需要用水清洗（）A福爾馬林B醋酸C苦味酸D重鉻酸鉀Ecarnoy液F鉻酸G升汞對(duì)于組織固定后的脫水，下面的描述不正確的是()A．脫水是借某些溶媒置換組織內(nèi)水分的過(guò)程B．脫水劑必須能與水以任意比例混合C．根據(jù)固定劑的要求選擇脫水劑D．根據(jù)被固定組織的要求選擇脫水劑E．乙醇是最常用的脫水劑屬于非石蠟溶劑的脫水劑（）屬于石蠟溶劑的脫水劑（）A乙醇B丙酮C叔丁醇D正丁醇F環(huán)己酮組織脫水后不需要透明直接浸蠟的脫水劑有（）A乙醇B丙酮C正丁醇D叔丁醇關(guān)于透明劑二甲苯的敘述正確的是（）A材料在二甲苯中停留過(guò)久，容易使材料收縮而變硬變脆B在封片前使用，不易使已染色的切片褪色C通常不直接移入二甲苯中，而是其間經(jīng)過(guò)幾個(gè)級(jí)度D對(duì)脫水不凈的切片，二甲苯不易進(jìn)入材料，故石蠟也不能透入，切片后將在蠟片上出現(xiàn)空洞不能用于已染色后的切片的透明的是（）A甲苯B二甲苯C苯D氯仿選用不同熔點(diǎn)的石蠟的原則：A石蠟硬度與組織硬度相近似，組織較硬時(shí)，用硬的石蠟，反之用軟的石蠟。。B切片較薄時(shí)（4um以下），石蠟的熔點(diǎn)為58-60℃.C通常在夏天用熔點(diǎn)高的石蠟-硬蠟，冬天用熔點(diǎn)低的石蠟-軟蠟。D浸蠟用石蠟的熔點(diǎn)應(yīng)該低于包埋用石蠟的熔點(diǎn)，這樣石蠟才容易透入。E石蠟浸蠟和包埋切極薄的片子時(shí),將2-3種不同熔點(diǎn)的石蠟混合使用，可得到較好的效果。包埋后的石蠟塊出現(xiàn)白色渾濁的石蠟結(jié)晶，原因是（）A材料脫水不充分B材料或石蠟中混有透明劑C包埋時(shí)動(dòng)作太慢，組織塊進(jìn)入包埋框時(shí)框內(nèi)四周的石蠟已成凝固狀態(tài)D石蠟?zāi)烫矔?huì)產(chǎn)生結(jié)晶。E石蠟本身品質(zhì)不良關(guān)于石蠟包埋敘述正確的是（）A注意溫度的控制，包埋時(shí)溫度太高，石蠟?zāi)烫?，?huì)在蠟塊中出現(xiàn)氣泡B如果將蠟塊突然放入水中，蠟塊會(huì)產(chǎn)生破裂；C溫度過(guò)低時(shí)材料與其周圍的石蠟不能凝固得緊密，也不易趕走氣泡，而不能切片。D夏季采用熔點(diǎn)較高的石蠟,冬季宜選用熔點(diǎn)較低的石蠟

切片染色后封片常用中性樹(shù)膠（加拿大樹(shù)膠）主要是因?yàn)椋?)A.樹(shù)膠與玻璃的折射率不相等B.樹(shù)膠與玻璃的折射率幾乎相等C.樹(shù)膠的折射率比玻璃大D.樹(shù)膠的折射率比玻璃小E.樹(shù)膠的折射率為1組織切片常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策圖1、2蠟塊的上下兩邊與刀片的水平線不平行圖4蠟塊粗修時(shí)沒(méi)有完全修全,組織沒(méi)有充分暴露最大面就急于裱片,切片上形成許多不規(guī)則的空洞圖6當(dāng)切蠟塊用的力太猛太重時(shí),組織中的小斑點(diǎn)、小斑塊從蠟塊中脫落,在切片上留下一個(gè)個(gè)小空洞圖單張切片,用鑷子沿蠟塊的底端平行牽拉,可形成蠟帶圖12、13切片跳片或厚薄不均圖15刀刃有缺口,造成切片有裂隙圖16、17組織內(nèi)有異物,造成切片有粗細(xì)不等的劃痕圖18切片刀上有碎組織廢屑或碎蠟屑等異物,造成切片上有輕微的劃痕圖26皮膚切片邊緣折疊圖27子宮肌瘤組織切片在漂烘儀水面沒(méi)有完全展開(kāi)形成皺折圖28切片在漂烘儀水面沒(méi)有完全展平,與載玻片帖附不牢固,形成波浪狀起伏,顯微鏡下難以聚圖22組織切片在漂烘儀展片時(shí)形成的氣泡,經(jīng)烘/烤片后染色時(shí)氣泡破裂,造成破裂區(qū)域染色深染9.染料與染色：[1]染色劑的性質(zhì)：具備兩個(gè)性質(zhì)，一要具有顏色，二要與被染組織間有親和力。

如果只有顏色而與被染物體之間無(wú)親和力，那只能是顏料或合色