第一章基因工程概述

基因工程原理與技術(shù)考核方法平時成績30%閉卷考試70%名詞解釋出勤課堂課堂表現(xiàn)作業(yè)填空題選擇題100%判斷題問答題主要參考資料王關(guān)林等.植物基因工程.科學(xué)出版社。吳乃虎等.基因工程原理.科學(xué)出版社。?生物技術(shù)通報?中國生物工程雜志?農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報?生物工程學(xué)報?生物技術(shù)?遺傳?Moleculargeneticsandgenomics

?Animalbiotechnology?Naturegenetics?

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Nature《基因工程原理與技術(shù)》第一章基因工程概述第二章基因工程的載體和工具酶第三章基因的常規(guī)技術(shù)第四章基因在大腸桿菌、酵母中的高效表達第五章轉(zhuǎn)基因植物第六章轉(zhuǎn)基因動物（自修）第七章基因治療（選講、自修）第一章緒論——基因工程概述第一節(jié)基因工程概念第二節(jié)基因工程的誕生和發(fā)展第三節(jié)基因工程的研究內(nèi)容第四節(jié)基因工程的成就和前景展望第一節(jié)基因工程概念一、基因工程的概念在分子水平上，提取或合成不同生物的遺傳物質(zhì)，在體外進行切割、再和某一載體進行拼接重組，然后再將重組的DNA導(dǎo)入宿主細胞內(nèi)，最后實現(xiàn)目的基因穩(wěn)定復(fù)制和表達的過程。簡單說：指異源重組DNA在受體細胞的擴增與表達。

DNA重組、擴增、表達是其三要素。生物工程biologicalengineering遺傳工程geneticengineering基因工程geneengineering分子克隆molecularcloning基因克隆genecloning基因操作genemanipulation重組DNA技術(shù)recombinantDNAtechnique二、基因工程的概念比較基因工程(geneengineering)常和以下名稱混用:基因工程與遺傳工程區(qū)別與聯(lián)系：

遺傳工程（GeneticEngineering)指人工改造物種遺傳性的技術(shù)。包括：基因工程、蛋白質(zhì)工程——分子水平染色體倍性、染色體代換——染色體水平細胞融合、花粉培育——細胞水平理化誘變、有性雜交、常規(guī)育種——個體水平

因此遺傳工程比基因工程有更廣泛的內(nèi)容，遺傳工程包括基因工程，但基因工程不等于遺傳工程?；蚬こ膛c生物工程區(qū)別與聯(lián)系：生物工程(Bioengineering):指以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進的生物工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，按照預(yù)先設(shè)計改造生物體或加工生物原料為人類生產(chǎn)所學(xué)的產(chǎn)品技術(shù)。因此，生物工程是新興的綜合性學(xué)科，是現(xiàn)代生物學(xué)產(chǎn)生的一切工程技術(shù)的總稱，包括：基因工程遺傳工程細胞工程(Cellengineering)

發(fā)酵工程(Fermentationengineering)

酶工程(Enzymesengineering)

食品工程(Foolsengineering)

生化工程(Biochemistryengineering)組織工程（Tissueengineering）克隆（Clone）原意指從一個共同祖先繁殖下來的一群遺傳上同一的細胞或個體所組成的細胞或個體的群體（相當(dāng)于我們每個人熟知的拷貝copy）。基因工程是異源重組DNA的擴增與表達故亦稱分子克?。╩olecularcloning）。“克隆羊”即是拷貝羊、復(fù)制羊“克隆人”即是拷貝人、復(fù)制人基因工程與分子克隆的聯(lián)系：上游技術(shù)：重組DNA的設(shè)計（原概念含義）；

下游技術(shù)：重組DNA的產(chǎn)業(yè)化與應(yīng)用包括DNA重組產(chǎn)物的分離純化、工廠化,生產(chǎn)的工藝與設(shè)備、應(yīng)用，環(huán)保的安全、管理、措施、法規(guī)，已單列一門課研究。基因工程與上、下游技術(shù)的關(guān)系：目前基因工程技術(shù)已產(chǎn)業(yè)化，基因工程概念升華為重組DNA的設(shè)計及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。區(qū)分為：第二節(jié)基因工程的誕生和發(fā)展一、基因泛基因階段1

順反子階段4

摩爾根的基因階段3

孟德爾遺傳因子階段2

現(xiàn)代基因階段

5基因的研究MendelG.J.(1822-1884).1856-1864豌豆雜交實驗。2Mendel的遺傳因子階段1866年發(fā)表論文，提出分離規(guī)律和獨立分配規(guī)律1900年Mendel遺傳規(guī)律被重新發(fā)現(xiàn)遺傳學(xué)的元年Mendel提出：生物的某種性狀是由遺傳因子負責(zé)傳遞的。是顆粒性的，體細胞內(nèi)成雙存在，生殖細胞內(nèi)成單存在。遺傳因子是決定性狀的抽象符號。1909年丹麥遺傳學(xué)家Yohannsen(1859-1927)發(fā)表了“純系學(xué)說”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel“遺傳因子”的概念。但沒有提出基因的物質(zhì)概念。3Morgan的基因階段1910年以后，MorganT.H.等提出了基因的連鎖遺傳規(guī)律。說明了基因是在染色體上占有一定空間的實體?；虿辉偈浅橄蠓?，被賦予物質(zhì)內(nèi)涵。連鎖遺傳規(guī)律的提出4順反子階段1957年，本澤爾（SeymourBenzer）以T4噬菌體為材料，在DNA分子水平上研究基因內(nèi)部的精細結(jié)構(gòu)，提出了順反子（cistron）概念。

順反子是1個遺傳功能單位，1個順反子決定1條多肽鏈。5.現(xiàn)代基因階段

1）操縱子

（啟動基因＋操縱基因＋結(jié)構(gòu)基因）2）跳躍基因

指DNA能在有機體的染色體組內(nèi)從1個地方跳到另一個地方，它們能從1個位點切除，然后插入同一或不同染色體上的另一個位置。3）斷裂基因

1個基因被間隔區(qū)分成不連續(xù)的若干區(qū)段，這種編碼序列不連續(xù)的間斷基因被稱為斷裂基因。4）假基因

不能合成出功能蛋白質(zhì)的失活基因

。5）重疊基因

不同基因的核苷酸序列有時是可以共用的即重疊的?，F(xiàn)代對基因的定義是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。

1973年是基因工程元年。（S.Cohen等獲得了卡那霉素和四環(huán)素雙抗性的轉(zhuǎn)化子菌落，在世界上第一次人工改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造新生命的成功。)理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術(shù)上的三大發(fā)明，對于基因工程的誕生起到了決定性的作用。二、基因工程的誕生1944年，AveryO.T.利用肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗三大理論：1、DNA是遺傳物質(zhì)被證實1944年，O.Avery和其同事作了一個實驗，肺炎球菌有兩種類型，一種是菌體細胞外包有多糖莢膜從而可以致病的類型，許多這樣的細菌集結(jié)在一起形成的菌落是光滑的(smooth)，所以稱作S型；另一類型不具莢膜也不致病，它的菌落是粗糙的（rough），稱作R型。格列菲斯把加熱殺死的S型與不能致病的R型細菌混和注入到小鼠體內(nèi)，結(jié)果小鼠致病而死。將死鼠體內(nèi)分離出的細菌進行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其中有大量的S型活菌。難道S型致病菌復(fù)活了嗎？Watson和Crick2、DNA雙螺旋模型的提出50年代，DNA的雙螺旋模型的提出和DNA復(fù)制機理的闡明

DNA是遺傳物質(zhì)已被證實，但是DNA是怎樣攜帶并傳遞遺傳信息的？在細胞增殖過程中，DNA是怎樣復(fù)制的？因此，對于DNA結(jié)構(gòu)的研究成為了當(dāng)時生物學(xué)家研究的熱點。

1953年，F(xiàn)rancisCrick和JamesWatson搜集了力所能及的資料，提出了DNA的雙螺旋模型。隨后，DNA的半保留復(fù)制和半不連續(xù)復(fù)制機理也被闡明，為基因工程的誕生奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。Nireberg等為代表的一批科學(xué)家3、“中心法則”和“操縱子學(xué)說”的提出60年代，確定了遺傳信息的傳遞方式（中心法則）

既然，DNA是遺傳信息的載體，那么它是如何傳遞遺傳信息的呢？遺傳信息又是如何控制生物的表型性狀的呢？以Nireberg等為代表的一批科學(xué)家經(jīng)過艱苦的努力，確定了遺傳信息以密碼方式傳遞，每三個核苷酸組成一個密碼子，代表一個氨基酸，到1966年，全部破譯了64個密碼子，并提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”。原核生物的基因調(diào)控操縱子模型1961年，JacquesMonod和FancoisJacob提出了原核基因調(diào)控的操縱子模型（operonmodel）。1970年Smith等分離并純化了限制性核酸內(nèi)切酶HindII，1972年，H.W.Boyer等相繼發(fā)現(xiàn)了ＥcoRI一類重要的限制性內(nèi)切酶。

三大技術(shù)：4、工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用1967年，世界上有五個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)DNA連接酶，特別是1970年H.G.Khorana等發(fā)現(xiàn)的T4DNA連接酶具有更高的連接活性。4、工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用

1969年，有人從美國黃石國家公園溫泉中的水生棲熱菌體內(nèi)分離純化出了耐熱的DNA多聚酶，后來的商品名叫Taq酶。4、工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用

1988年，西特斯公司的研究者們開始在PCR中使用Taq酶。這是PCR技術(shù)的重大改進，在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)了反應(yīng)的自動化，從而PCR技術(shù)得到了極為廣泛的應(yīng)用。1970年，Baltimore等和Temin等在RNA腫瘤病毒中各自發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶，完善了中心法則，用于構(gòu)建cDNA

文庫。4、工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用載體主要是小分子量的復(fù)制子如：病毒、噬菌體、質(zhì)粒。1972年，美國Stanford大學(xué)的P.Berg等首次成功地實現(xiàn)了DNA的體外重組；5、載體的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用SV40λ噬菌體EcoRIEcoRIT4連接酶第一個重組分子6、重組子導(dǎo)入受體細胞技術(shù)1944年，肺炎鏈球菌被成功轉(zhuǎn)化。1970年，大腸桿菌才被成功轉(zhuǎn)化，得益于CaCl2的應(yīng)用。1973年，Stanford大學(xué)的Cohen等成功地利用體外重組實現(xiàn)了細菌間性狀的轉(zhuǎn)移。1973年被定為基因工程誕生的元年。基因工程誕生基因的研究曾經(jīng)是一片被冷落的“處女地”，而基因工程的誕生使基因成為人們競相研究和爭奪的對象，基因就好比灰姑娘因為水晶鞋而突然變得光彩照人、身價百倍?；蚬こ獭Яλ谌?jié)基因工程的研究內(nèi)容一、基因工程研究的主要內(nèi)容1.基礎(chǔ)研究2.克隆載體的研究3.受體系統(tǒng)的研究4.目的基因的研究5.生物基因組學(xué)的研究二、基因工程研究的基本操作程序1、從生物體中分離得到目的基因（或DNA片段）2、在體外，將目的基因插入能自我復(fù)制的載體中得到重組DNA分子。3、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞中，并進行繁殖。4、選擇得到含有重組DNA分子的細胞克隆，并進行大量繁殖，從而使得目的基因得到擴增。5、進一步對獲得的目的基因進行研究和利用。例如，序列分析、表達載體構(gòu)建、原核表達以及轉(zhuǎn)基因研究和利用等。第四節(jié)基因工程的成就和研究進展成就：在醫(yī)藥領(lǐng)域在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域在工業(yè)領(lǐng)域研究進展：主要講中國的一、醫(yī)藥領(lǐng)域1977年，激素抑制素的發(fā)酵生產(chǎn)成功。Itakara等，化學(xué)合成的激素抑制素基因和大腸桿菌-半乳糖（苷）激酶基因插入到PBR322中得到重組質(zhì)粒，并通過大腸桿菌生產(chǎn)出含有激素抑制素的嵌合型蛋白，經(jīng)溴化氰處理后釋放出了有生物活性的激素抑制素。首次實現(xiàn)了真核基因的原核表達。用價值幾美元的9升培養(yǎng)液生產(chǎn)出50毫克的生物活性物質(zhì)，這相當(dāng)于50萬頭羊腦的提取量，使SMT售價由5萬美元/g降至300美元/g。

1978年，Goeddel等，人胰島素的發(fā)酵生產(chǎn)成功。1979年，Goeddel等，又在大腸桿菌中成功表達了人生長激素基因。1980年，Nagata等，遺傳工程菌生產(chǎn)干擾素獲得成功。1981年，用遺傳工程菌生產(chǎn)的生物制劑包括動物口蹄疫疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原及核心抗原、牛生長激素等。1982年，重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的藥物-人胰島素進入商品化生產(chǎn)。1983年，基因工程產(chǎn)狂犬病疫苗取得突破型進展。制藥業(yè)的發(fā)展經(jīng)歷了：由外源基因→原核表達→酵母表達→動物表達：喝牛奶防癌；植物表達：吃香蕉治乙肝。堿性成纖維細胞生長因子231元/ug紅細胞生成素1072元/ug白細胞介素-2410元/ug巨細胞粒細胞集落刺激因子1960元/ug胰島素10.2元/mg世界主要生物藥品年銷售額（億美元）

EPO16.5

葡萄糖腦苷酯酶2.15抗CD3MAb

0.8人白細胞介素20.40凝血因子VIII2.5

α-干擾素7.00G-CSF9.36

β-干擾素2.55GM-CSF0.41

γ-干擾素0.04

tPA3.0

人生長激素4.50B型肝炎疫苗

10.0

人胰島素7.00

中國基因工程制藥200多家生物技術(shù)公司生物技術(shù)藥品產(chǎn)值：1996-18億元；1997-30億元；2000-72億元可生產(chǎn)藥物品種：約20種‘83‘84‘85‘86‘87‘88‘89‘90‘91‘92‘93‘94‘95‘96‘97‘98‘99‘00‘01‘02FirsttransgenicplantDelay-ripeningtomatoCommercializedintheUSFirst

field

testsHerbicideresistant,insectresistantplantscommercializedGMmaizeapprovedbyEU

FirstBtcornplantsRottingresistanttomatoapprovedbyFDA植物基因工程的發(fā)展迅速二、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域植物轉(zhuǎn)基因育種的發(fā)展優(yōu)勢1、擴大了作物育種的基因庫

轉(zhuǎn)基因育種打破了常規(guī)育種的物種界限，來源于動植物和微生物的有用基因都可以導(dǎo)入作物，培育成具有某些特殊性狀的新型作物品種。2、提高了作物育種的效率

作物轉(zhuǎn)基因育種不僅大大縮短育種年限，而且可成功地改良某些單一性狀卻不影響改良品種的原有優(yōu)良特性。3、減輕了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對環(huán)境的污染轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花的大面積種植和推廣，不僅可以減少化學(xué)殺蟲劑對棉農(nóng)及天敵

的傷害，而且可以大幅度降低用于購買農(nóng)藥和蟲害防治的費用。另外，隨著高效固氮轉(zhuǎn)基因作物及高效吸收土壤中磷元素等營養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)基因作物不斷問世和推廣，農(nóng)用化肥的利用率將極大地提高，這對減少農(nóng)田污染具有重要意義。4、拓寬了作物生產(chǎn)的范疇各種有價值的蛋白產(chǎn)品都可以利用植物反應(yīng)器進行高效生產(chǎn)，番茄、馬鈴薯、萵苣和香蕉等作物已被成功用于生產(chǎn)口服疫苗。另外，各種工業(yè)原料，比如纖維素、海藻糖和可降解塑料等也可以用植物來生產(chǎn)。有人甚至預(yù)言，除了鋼筋混凝土之外，未來的轉(zhuǎn)基因作物將可能生產(chǎn)出人類所需要的一切產(chǎn)品。全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積（百萬公頃）全球轉(zhuǎn)基因作物導(dǎo)入特性比例植物基因工程研究植物基因組計劃植物分子育種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效和多抗性植物作為反應(yīng)器香蕉、馬鈴薯、番茄等水稻、玉米、棉花、大豆、高粱和番茄酒精、石油、工業(yè)酶等※植物可成為一個制藥廠：吃香蕉治乙肝，吃馬鈴薯治療痢疾，吃番茄治療癌癥即將實現(xiàn)。煙草葉片膠囊可能是多種藥物的制劑，煙草商可能不再擔(dān)心“禁煙”帶來的損失?！参锸且蛔S：用油菜生產(chǎn)熱帶月桂樹特產(chǎn)的月桂酸，使美國節(jié)省了因進口月桂酸而消耗的4億美元。石油危機將可能找到解決新途徑。這一切使農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)發(fā)生巨變，亦將使制藥業(yè)、化工業(yè)發(fā)