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文檔簡介
放射免疫法和ELISA之間的差別
付濤(2012881007)2023/2/3浙江萬里學(xué)院放射免疫法一、原理:利用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體,然后與被測的抗體或抗原結(jié)合,形成抗原抗體復(fù)合物的原理來進(jìn)行分析的。2023/2/3浙江萬里學(xué)院分析方法放射免疫法分析有兩種方法:競爭性RIA,又稱傳統(tǒng)RIA非競爭性RIA,又稱免疫放射分析(IRMA)2023/2/3浙江萬里學(xué)院競爭性RIA
主要特點(diǎn):標(biāo)記的是抗原。其原理:未知抗原Ag+標(biāo)記抗原Ag*+已知定量抗體Ab標(biāo)記抗原與抗體復(fù)合物Ag*Ab+未知抗原與抗體復(fù)合物AgAb+游離標(biāo)記抗原Ag*(去除)。2023/2/3浙江萬里學(xué)院基本原理Ag-Ab+Ag*AgAbAg++*Ag-Ab+
*Ag(B)復(fù)合物(F)游離物
*Ag與Ag的免疫活性相同*Ag+Ag>
AbAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg>*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag<*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)2023/2/3浙江萬里學(xué)院Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag++++++++++++++++++++2023/2/3浙江萬里學(xué)院Ag2550100200400800*AgAb分離B、FB%=B/(B+F)F%=F/(B+F)R=B/FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456濃度2023/2/3浙江萬里學(xué)院B%標(biāo)準(zhǔn)曲線2023/2/3浙江萬里學(xué)院在體外條件下,Ag與定量的*Ag對(duì)限量的特異性Ab的競爭結(jié)合反應(yīng)。B%F%B/F1.02.0CalibrationCurve602023/2/3浙江萬里學(xué)院(一)基本試劑1、抗體2、標(biāo)記抗原3、非標(biāo)記抗原(標(biāo)準(zhǔn)品)二、基本方法化學(xué)結(jié)構(gòu)、免疫活性與被測抗原相同高純度2023/2/3浙江萬里學(xué)院1、抗體1)親合常數(shù)K(affinityconstantK)反應(yīng)抗體與抗原的結(jié)合能力2)交叉反應(yīng)率反應(yīng)抗體的specificity
3)滴度(titer)抗體的稀釋倍數(shù)
B/F0.51.0復(fù)合物濃度123·····斜率=-K10100100010000100000Ab稀釋度工作滴度高親和力高特異性高滴度Scatchard作圖2023/2/3浙江萬里學(xué)院2、標(biāo)記抗原1)比活度和放化純度足夠高比活度——每微克抗原上標(biāo)記放射性核素的千貝可數(shù)(KBq/μg)放化純度——具有免疫活性的標(biāo)記抗原占總放射性的百分?jǐn)?shù)。>90%2)半衰期足夠長3)保持原有抗原的特性125I—大分子、3Hor125I—小分子2023/2/3浙江萬里學(xué)院(二)B和F的分離1、第一類2、第二類雙抗體沉淀法PEG沉淀法固相第二抗體法二、基本方法+AgAb(1)Ab(2)試管Ab(2)Ab(1)Ag可溶性復(fù)合物可沉淀復(fù)合物2023/2/3浙江萬里學(xué)院三、質(zhì)量控制(qualitycontrol)1、精密度(precision)
變異系數(shù)(CV)2、準(zhǔn)確度(accuracy)
回收率=測定值/真實(shí)值×100%90%~110%
3、靈敏度(sensitivity)方法的最小可測量4、特異性(specificity)交叉反應(yīng)率5、可靠性(validity)平行性試驗(yàn)6、穩(wěn)定性(stability)B0%,NSB,ED25,ED50,ED75
ABC2023/2/3浙江萬里學(xué)院RIA小結(jié)靈敏度高特異性好精確的定量方法操作簡便2023/2/3浙江萬里學(xué)院非競爭性RIA(MISA)主要特點(diǎn):標(biāo)記的是抗體。按反應(yīng)原理又分兩種:單位點(diǎn)IRMA,其原理:抗原只有一個(gè)抗原決定簇,所測的抗原為小分子抗原。雙位點(diǎn)IRMA:抗原有兩個(gè)抗原決定簇,所使用的兩種亞型抗體在與同一抗原分子結(jié)合時(shí)互不干擾。2023/2/3浙江萬里學(xué)院免疫放射分析法*Ab+Ag-*Ab
+
*Ab(immunoradiometricassay,IRMA)B%Ag(B)(F)2023/2/3浙江萬里學(xué)院
IRMA與RIA工作原理的主要區(qū)別RIAIRMA競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)非競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)采用標(biāo)記抗原采用標(biāo)記抗體三種主要反應(yīng)試劑二種主要反應(yīng)試劑所用抗體是限量的所用抗體是過量的*AgAb的量與待測Ag的量呈負(fù)相關(guān)Ag*Ab的量與待測Ag的量呈正相關(guān)反應(yīng)到達(dá)平衡慢反應(yīng)到達(dá)平衡快非特異結(jié)合主要影響高劑量區(qū)非特異結(jié)合主要影響低劑量區(qū)低劑量區(qū)有不確定因素低劑量區(qū)無不確定因素2023/2/3浙江萬里學(xué)院ELISAELISA即酶聯(lián)免疫吸附測定。其基本原理有三條:
(1)抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫學(xué)活性;
(2)抗原或抗體可通過共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物,而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性;
(3)酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后,可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在,而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的,因此,可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。2023/2/3浙江萬里學(xué)院ELISA過程包括:抗原(抗體)吸附在固相載體上稱為包被,加待測抗體(抗原),再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體(抗原),生成抗原(抗體)--待測抗體(抗原)--酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物,再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體(抗原)的量。待測抗體(抗原)的定量與有色產(chǎn)生成正比。2023/2/3浙江萬里學(xué)院ELISA常用的四種方法
1.直接法測定抗原
1、將抗原吸附在載體表面;2、加酶標(biāo)抗體,形成抗原—抗體復(fù)合物;3、加底物。底物的降解量=抗原量。
2.間接法測定抗體1、將抗原吸附于固相載體表面;2、
加抗體,形成抗原-抗體復(fù)合物;3、加酶標(biāo)抗體;4、加底物。測定底物的降解量=抗體量。
2023/2/3浙江萬里學(xué)院間接法洗滌洗滌洗滌待測抗體酶標(biāo)抗抗體2023/2/3浙江萬里學(xué)院3.雙抗體夾心法測定抗原1、將抗原免疫第一種動(dòng)物獲得的抗體吸附于固相表面;2、加抗原,形成抗原-抗體復(fù)合物;3、加抗原免疫第二種動(dòng)物獲得的抗體,形成抗體抗原抗體復(fù)合物;4、加酶標(biāo)抗抗體(第二種動(dòng)物抗體的抗體);5、加底物。底物的降解量=抗原量。2023/2/3浙江萬里學(xué)院雙抗體夾心法洗滌洗滌洗滌待測抗原2023/2/3浙江萬里學(xué)院
4.競爭法測定抗原(1)將抗體吸附在固相載體表面;(2)加入酶標(biāo)抗原(3)加入酶標(biāo)抗原和待測抗原;(4)加底物。
對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差=未知抗原量。
2023/2/3浙江萬里學(xué)院競爭法洗滌洗滌待測抗原酶標(biāo)抗原2023/2/3浙江萬里學(xué)院ELISA實(shí)驗(yàn)步驟2023/2/3浙江萬里學(xué)院洗板步驟每空加洗滌液350ul,30秒甩甩盡孔內(nèi)液體,吸水紙上拍干盡孔內(nèi)液體,吸水紙上拍干重復(fù)3次2023/2/3浙江萬里學(xué)院ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值減去空白孔的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,查出標(biāo)本濃度2023/2/3浙江萬里學(xué)院放射免疫法和ELISA之間的差別
1)放射免疫分析通過放射活性分子共價(jià)交聯(lián)至抗體或抗原上,免疫反應(yīng)后測定放射活性分子的放射信號(hào)來定量檢測相應(yīng)抗體或抗原等,可用于測定包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲、腫瘤以及小分子藥物等的多種抗原和抗體。由于該方法特異性好,靈敏度高,且儀器自動(dòng)化,操作簡便,樣品制備簡單等,因而自50年代末問世以來已在許多領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。但該方法中操作人員需要接觸放射性物質(zhì),會(huì)損害操作人員的身體,同時(shí)測定完成后放射性材料的處置也是個(gè)嚴(yán)重的問題。2023/2/3浙江萬里學(xué)院總結(jié)
2)酶免疫分析是將抗原、抗體的特異性免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來的一種免疫分析方法。將特定的酶標(biāo)記在抗原或抗體上,在免疫反應(yīng)后,通
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