鴨坦布蘇病毒病防治關鍵技術研究及應用 醫(yī)療臨床醫(yī)學專業(yè)

鴨坦布蘇病毒病防治關鍵技術研究及應用Keytechnologyresearchandapplicationofducktembusuvirusdiseasecontrol目錄TOC\o"1-4"\h\u9950摘要 V20088Abstract VI23500縮略詞表 I19484第一章綜述 210801鴨坦布蘇病毒病 227982病原學 2192292.1生物學分類 2105672.2形態(tài)結構及理化培養(yǎng)特性 280863鴨坦布蘇病毒病的主要流行病學特征 28834江西省蛋鴨場鴨坦布蘇病毒病流行概況 3225095鴨坦布蘇病毒診斷方法 474215.1臨床診斷 4323255.2實驗室診斷方法 485015.2.1病原檢測 470385.2.2免疫組化方法 574295.2.3間接免疫突光試驗 5149115.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗 625680第二章研究的目的及意義 727470第三章材料與方法 8264831材料 875761.1實驗動物及病料來源 886071.2主要試劑 8285711.3菌株與細胞 8202551.4常用試劑及緩沖液配制 833521.5主要儀器 8212011.6分析軟件及說明 98072病原分離鑒定實驗 9113492.1樣品采集 915782.1.1樣品背景調查 9114552.1.2樣品采集 10164412.2病原分離 10178702.2.1病毒提取分離 10133002.2.2引物設計 10286682.2.3病毒RNA提取及第一鏈合成 11242922.2.4全基因擴增與克隆 11178872.3基因測序 11245203病毒復制試驗 12101583.1病毒增殖培養(yǎng) 12185713.2病毒含量測定 1240813.3實驗分組及攻毒 12165713.4攻毒效果評價 12191014病毒傳播途徑探究試驗 1311894.1病毒增殖培養(yǎng) 1326094.2實驗分組及方法 13283074.3實驗效果評價 13293225鴨坦布蘇病毒防治試驗 13252785.1毒株、疫苗來源 13121695.2中草藥配制 13317195.3實驗分組及方法 1476185.4實驗效果評價 1414706流行病學調查及田間應用試驗 15322066.1調查與應用試驗范圍 15316176.2開展方式 15120196.3實驗效果評價 1513422第四章實驗結果 1651791病原分離鑒定實驗 16299591.1PCR結果 1679971.2序列比對結果 1749202病毒復制試驗 1856622.1臨床結果 1932912.2PCR檢測結果 1957723病毒傳播途徑探究試驗 19110553.1臨床結果 1996813.2病理剖檢結果 20254074鴨坦布蘇病毒防治試驗 21241024.1試驗后產蛋變化結果 21251674.2致死率結果 21283494.3剖檢病理變化結果 22249605流行病學調查及田間應用試驗 24186935.1流調結果 24242495.2田間應用結果 25219586結論與討論 2612630參考文獻 2824818致謝 32摘要鴨坦布蘇病毒病（DuckTembusuvirusdisease,DTMUVD）是由鴨坦布蘇病毒（DuckTembusuvirus,DTMUV）引起的一種以蛋鴨產蛋大幅下降為主要特征的急性、烈性傳染病。自2010年4月起，鴨坦布蘇病毒?。―TMUVD）在我國部分地區(qū)相繼暴發(fā)，在江西、安徽、河南、福建、廣東、河北、山東、江蘇、浙江、廣西等地部分鴨場均有過報道，該病病程約為1～2個月，會引起蛋鴨產蛋大幅下降，耐過的種鴨群可逐漸恢復產蛋，但淘汰率一般在10%～30%之間，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴重的經濟損失[1-6]。近些年以來，該病的發(fā)病率雖然出現降低趨勢，但是仍然存在高效防治措施不多、疫病暴發(fā)的原因尚未明確、動物回歸的試驗開展難度較大、疫病傳播的途徑不夠詳實等問題，為該病防控帶來了巨大的挑戰(zhàn)。本文旨在運用我省自主分離純化的流行毒株進行病毒復制試驗及防治研究，確定我省蛋鴨減蛋癥致病原因，系統(tǒng)運用中草藥制劑對當前鴨坦布蘇病毒病防治效果進行研究，確定最優(yōu)防治鴨坦布蘇病毒病的藥物組方，獲得藥效學和安全性分析基礎數據，以期為開展好該病的防控提供科學性的建議與指導。研究的具體結果包括：一、鴨坦布蘇病毒病病原學、生物學特性研究1.通過病毒復制實驗，結果證明實驗成功復制鴨坦布蘇病毒病，經病毒分離、基因序列測定分析表明，其病原為黃病毒科黃病毒屬的坦布蘇??；鴨坦布蘇病毒病不僅具有致病性，且是獨立的病毒種類，具有可復制性，且在感染機體內能夠穩(wěn)定存在。2.通過鴨坦布蘇病毒病傳播實驗，結果證明鴨坦布蘇病毒病不僅具有致病性，且能夠通過混群接觸感染、空氣傳播等方式進行傳播，在日常生產過程中對患病鴨群應盡早實行較好的隔離措施等方式，才能阻止疫病的傳播。二、鴨坦布蘇病毒病臨床研究3.通過鴨坦布蘇病毒過預防用藥與攻毒實驗，結果證明本試驗所選用F疫苗和中草藥1組、2組配方均能很好地控制鴨坦布蘇病毒對鴨群產蛋的危害，能夠顯著地增強鴨群抵抗力，減輕卵巢的損傷，縮短恢復產蛋的時間；但是中草藥1組配方在治療時沒能很好的控制蛋鴨死亡，鴨群死亡率為3.33%。疫苗是預防該病發(fā)生與防控的較好選擇，中草藥在預防該病防控與治療中有一定效果，但用法、用量及生產效益比等仍需進一步深入研究。關鍵詞：鴨坦布蘇病毒病，中草藥，生物學特性，疫病傳播，疫病防控AbstractDucktembusuvirusdisease(DTMUVD)isanacuteandstronginfectiousdiseasecausedbyDuckTembusuvirus(DTMUV).SinceApril2010,templeSueducktembusuvirusdisease(DTMUVD)outbreaksinpartsofourcountryandinjiangxi,anhui,henan,fujian,guangdong,hebei,shandong,jiangsu,zhejiang,guangxiandotherplacesofYaChangwerereported,andthediseasecourseofabout1~2months,canleadtoasignificantdeclineineggproductionpathogenies,resistanttothekindsofduckscangraduallyrestoretheeggs,butselective,generallybetween10%~30%,suppliesseriescausedseriouseconomiclosses[1-6].Inrecentyears,althoughtheincidenceofthediseaseappearedtoreducethetrend,buttherearestillfeweffectivepreventionandcontrolmeasures,thecauseofthediseaseoutbreakisnotyetclear,animalregressiontestisdifficult,thespreadoftheepidemicapproachessuchproblemsasinsufficient,broughtahugechallengeforthediseasecontrolandprevention.Thepurposeofthispaperistouseourprovinceautonomouspurificationofpandemicstrainforpreventionandcontrolofviralreplicationtestandresearch,determinethepathogenieseggdiseasecausesreductioninourprovince,thesystemuseofChineseherbalmedicinepreparationforthecurrentducktempleSuevirusdiseasepreventionandcontroleffectarestudied,determiningtheoptimaldrugpreventionandcontrolofducktempleSuevirusdiseasecharacteristics,basisofpharmacodynamicsandsafetyanalysisdata,inordertocarryoutwellthepreventionandcontrolofthediseasetoprovidescientificadviceandguidance.Specificresultsofthestudyinclude:1.Studyontheetiologyandbiologicalcharacteristicsofducktambusuvirusdisease.1.ThroughtheviralreplicationexperimentresultsshowthattheexperimentsuccessfullycopiedducktempleSuevirusdisease,afterthevirusseparation,determinationofgenesequenceanalysisshowedthatthepathogenofyellowvirusflavivirusgenustempleSuedisease;Itisnotonlypathogenic,butalsoindependentvirusspecies,whichisreproducibleandcanbestableintheinfectedorganism.2.ThroughthetempleSueduckviraldiseasetransmissionexperiment,theresultsshowthattheducktempleSuenotonlyhasthepathogenicvirusdisease,infection,andcanbemixedgroupofcontactintheformofairandspread,indailyproductionprocessforsickducksgoodisolationmeasuresshallcomeintoforceassoonaspossible,topreventthespreadofthedisease.Ii.Clinicalstudyofducktembusuvirusdisease.3.ThroughtheducktempleSueviruspreventiondrugandpoisonattackexperiment,theresultsprovethatthisexperimentchoosesFvaccineandChineseherbalmedicineformula1group,2groupwerewellcontrolledducktempleSuevirusduckstotheharmofeggproduction,cansignificantlyenhanceducksresistance,reduceovarianlesions,shortentherecoverytimeofegg;However,theformulaof1groupofChineseherbalmedicinefailedtocontrolthedeathoftheduck,andthedeathratewas3.33%.Vaccineisagoodchoiceforpreventionofthediseaseoccurrenceandpreventionandcontrol,Chineseherbalmedicineinthepreventionofthediseasecontrolandpreventionandtreatmenthasacertaineffect,buttheusage,dosageandtheproductionefficiencyratiostillneedsfurtherresearch.Keywords:ducktembusuvirusdisease,Chineseherbalmedicine,biologicalcharacteristics,epidemicdiseasetransmission,epidemicpreventionandcontrol.縮略詞表AbbreviationsTable英文縮寫英文全稱中文名稱minhSMLbpkDaELISAMinuteHourSecondMilliliterBasepairKilodaltonEnzyme-linkedimMunosorbentassay分鐘小時秒毫升堿基對千道爾頓酶聯(lián)免疫吸附試驗DTMUVDuckTembusuvirus鴨坦布蘇病毒IHCImmuno-Histochemistry免疫組織化學DTMUVDDuckTembusuvirusdisease鴨坦布蘇病毒病第一章綜述1鴨坦布蘇病毒病鴨坦布蘇病毒?。―uckTembusuvirusdisease,DTMUVD）是由鴨坦布蘇病毒（DuckTembusuvirus,DTMUV）引起的一種急性、烈性傳染病，以蛋鴨產蛋大幅下降為主要特征的。該病的流行特點表現為發(fā)病急、傳播速度快、發(fā)病率高等，會導致蛋鴨產蛋迅速下降甚至停產。發(fā)病前期主要表現為持續(xù)高熱，發(fā)病鴨群后期會出現一定比例的神經癥狀，臨床表現為癱瘓、翻滾、站立不穩(wěn)及共濟失調。該病發(fā)病率可高達100%，但病死率較低，約為5～15％[1-6]。2病原學2.1生物學分類在分類學上，鴨坦布蘇病毒(DTMUV)歸屬于黃病毒科（Flaviviridae）的黃病毒屬（Flavivirus）中恩塔亞病毒群（Ntayavirusgroup）的坦布蘇病毒（Tembusuvirus）[7-8]。2.2形態(tài)結構及理化培養(yǎng)特性鴨坦布蘇病毒（DTMUV）具有典型的黃病毒形態(tài)特征，病毒粒子呈現球形狀，表面有纖突和囊膜，直徑約為50nm。該病毒不耐熱，對乙醚和氯仿較為敏感[9]；該病毒不具備血凝活性，無法凝集雞、鴨、鵝、鶴、人、鼠、豬、兔等的紅細胞。鴨坦布該蘇病毒（DTMUV）增殖載體較多，在鴨胚、雞胚、Vero細胞和鴨胚成纖維細胞中均可以增殖，主要在感染細胞的胞漿內復制[10]。鴨坦布該蘇病毒經尿囊腔接種鴨胚3～5d后死亡，表現為絨毛尿囊膜增厚、水腫，胚體水腫、出血，表現為折光性增強，細胞變圓及融合，最終崩解死亡[11-13]。2.3基因結構鴨坦布蘇病毒（DTMUV）具有黃病毒典型的基因組特征，是單股正鏈的RNA病毒，有衣殼。病毒基因組全長10,990nt，基因組順序為5'-UTR-C-prM/M-E-NS1-NS2A/2B-NS3-NS4A/4B-NS5-UTR-3'。開放閱讀框為10278nt，5'端及3'端的非編碼區(qū)長度分別為94nt和618nt[28-32]。外膜蛋白E上連續(xù)7個氨基酸的抗原區(qū)域主要集中在20-400位氨基酸，分別為：E25-33，E52-74，E79-88，E118-127，E148-161，E166-174，E178-186，E215-230，E243-252，E261-270，E285-292，E313-319，E351-357，E388-398。在E蛋白的103-105位和154-156位存在兩個糖基化位點（分別為NGC和NYS）[34-43]。3鴨坦布蘇病毒病的主要流行病學特征黃病毒屬大多數病毒危害較大，是一種可引起腦炎、脊髓炎、明顯的神經癥狀的人畜共患、自然疫源性疾病的病毒，比如登革熱病毒、腦炎病毒、西尼羅病毒、黃熱病病毒等[9,33]。鴨坦布蘇病毒（DTMUV）也不例外，站立不穩(wěn)，臥地不起等神經癥狀在鴨感染后該病毒都均有表現，但除此之外，該病毒與其他黃病毒屬病毒不同的是地方還表現于該病毒可致蛋鴨卵巢病變，從而導致產蛋下降[14-20]。DTMUV幾乎可感染所有品種的鴨，尤其是對麻鴨的致病力最強，易感染群主要以產蛋鴨群為主，現也有在雞]、種鵝]和野鴨體內也分離到該病毒的報道，可見其致病范圍之廣[21-29]。本病的流行病學的確切研究目前尚未看見報道，但從臨床角度來看，如果鴨舍中一欄鴨發(fā)病后，疫病擴展到整棟鴨舍時間只需要1-2天內，同一地區(qū)的其他鴨場一周之內即可蔓延到達[13]，通過開展動物實驗來驗證，與病鴨同居可感染發(fā)病，由此推斷出，水平傳播為該病毒的主要傳播方式，尤其是經過呼吸道的傳播，動物的采食及飲水也有可能傳播該病[6,14]。因為黃病毒屬大部分成員的傳播方式為蚊蟲傳播，所以DTMUV經蟲媒傳播的可能性也存在。但根據有關數據顯示，在北方地區(qū)在秋冬季節(jié)，蚊蟲活動相對較少，但仍然有DTMUVD大面積的流行的情況，而且白蛉和蚊蟲的飛行距離較為有限，這與該疫情可以在短時間內大范圍暴發(fā)的情況不大相符。目前尚無蚊子體內病毒的分離和動物回歸試驗報道，且病毒傳播期間的溫度變化與其他節(jié)肢動物傳播的其他黃病毒的發(fā)病時間也不一致，所以目前該病毒不一定是以節(jié)肢動物為主要傳播媒介，一些鳥類也有可能是傳播媒介[9,15]。趙冬敏等[16]發(fā)現該病毒在種鵝中可通過鵝胚傳到下一代，說明該病毒可經垂直傳播。4江西省蛋鴨場鴨坦布蘇病毒病流行概況在上世紀90年代，就有DTMUVD發(fā)生的報道，1997年，一種疑似黃病毒的有囊膜病毒被溫立斌等[17]從石家莊、邢臺等地出現產蛋下降、神經癥狀的康貝爾鴨子中分離到，初步命名為“鴨病毒性腦炎”。從2010年開始，僅僅幾個月的時間，該病就在我國突然大規(guī)模爆發(fā)，席卷了我國絕大多數養(yǎng)鴨地區(qū)。隨后，相繼報道了種鴨和蛋鴨產蛋下降的病例，并從病例中分離到一種黃病毒。從發(fā)病種鴨中分離出了一種新型黃病毒，命名為BYD病毒。起初，該病有多種命名，鴨病毒性腦炎、鴨出血性卵巢炎、鴨黃病毒感染、如鴨產蛋下降綜合癥、鴨坦布蘇病毒感染等均被使用過。經過大量的研究發(fā)現，導致鴨群發(fā)病的這種黃病毒在進化關系上，與1955年從馬來西亞庫蚊中分離到的坦布蘇病毒非常相近[19]。因此，該病名稱于2011年中國畜牧獸醫(yī)學會第一屆水禽疫病防控研討會將統(tǒng)一，命名為“鴨坦布蘇病毒病”。2010年，DTMUVD被報道傳入江西省，給江西省養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大經濟損失。自2015年9月份以來，江西省大多數蛋鴨養(yǎng)殖集中區(qū)相繼出現產蛋鴨產蛋率突然大幅下降的情況，該疫病在樂平市、鄱陽縣、弋陽縣、新建區(qū)、豐城市、宜豐縣等地均有爆發(fā)。通過對發(fā)病群體的臨床癥狀、剖檢觀察、病毒分離、基因測序和動物回歸試驗等技術手段，確定了該病的致病原因是DTMUV[19]。2016年3～5月，筆者對江西省蛋鴨養(yǎng)殖密集區(qū)進行了大量調查，先后到九江、吉安、南昌、鷹潭、景德鎮(zhèn)等5個地市的20個養(yǎng)殖場（其中包括了3個發(fā)病場），共采集血清和棉拭子樣品524份，對采集的樣品進行熒光定量RT-PCR檢測。通過實地調查和實驗室檢測，結果顯示鴨坦布蘇病毒感染率較高，鴨坦布蘇病毒感染在3個發(fā)病場（其中包括1個鵝發(fā)病場）均被檢測出；20個被調查的養(yǎng)殖場中，有18個場檢測出DTMUV陽性，養(yǎng)殖場帶毒率高達90%。5鴨坦布蘇病毒診斷方法5.1臨床診斷產蛋鴨感染DTMUV的主要臨床表現為釆食量大幅下降，嚴重時甚至出現食欲廢絕現象，產蛋率亦隨之急劇下降，可由產蛋高峰期的90%～95%在短期內下降至5%～10%。該病的發(fā)病率高達100%，而且感染后該病的死淘率達到了5%～15%，繼發(fā)感染時鴨群死淘率可達30%[40-44]。流行初期病鴨會出現體溫升高、排綠色稀糞的臨床癥狀，后期神經癥狀表現更加明顯，會出現頭頸抽搐、共濟失調的情況，雙腿向后伸展，甚至癱瘓，嚴重病鴨會導致死亡。病鴨所產種蛋受精率會受到較大影響，受精率會降低10%左右。該病病程一般為1～1.5個月，可自行逐漸恢復[45]。體質好的鴨群，尤其是剛開產或產蛋高峰期的鴨群，產蛋率一般可以恢復到發(fā)病前的產蛋水平。蛋鴨在感染該病后，恢復后期多數會出現一個明顯的換羽過程。商品肉鴨和育成期的種鴨發(fā)病后臨床癥狀表現以神經癥狀為主，表現站立不穩(wěn)、倒地不起、行走不穩(wěn)，發(fā)病期一般在20～40日齡，病鴨有飲欲和食欲，但多數會出現飲水、釆食困難的情況，因此病鴨容易因進水進食困難而衰竭死亡，死淘率為10%～30%[45-47]。5.2實驗室診斷方法5.2.1病原檢測5.2.1.1電鏡法在實驗室診斷方式中，一般可根據病毒本身具有的形態(tài)、結構和大小等不同的特征，利用電鏡技術進行直觀、準確地病毒鑒別，此診斷方法較為直觀。用DTMUV感染DF-1細胞72h后，2.5％戊二酵固定，制作超薄的病理切片，通過電鏡觀察，發(fā)現該病毒有球形、有囊膜、有纖突的病毒粒子，病毒粒子直徑大約50nm[47-50]。該方法雖然能直觀地觀察到病原體，但需要專業(yè)技術人員才能操作，操作步驟也比較繁瑣，且該檢測法對病毒量有較高的要求，所以不能用于快速診斷。5.2.1.2病毒分離病毒分離接種法經常用于分離檢測活的病毒，是一種較為傳統(tǒng)且經典的病毒檢測技術。感染DTMUV的病鴨適宜分離病毒的部位有卵泡膜、腦、脾臟、肝臟等病變組織，其中最易分離和檢測到病毒的是卵泡膜和卵巢中。DTMUV在鴨胚、雞胚、鴨胚成纖維細胞及Vero細胞中初次分離的成功率僅為20.6％，低于臨床樣品RT-PCR檢出率[46-52]。乳鼠腦內接種法和細胞接種分離法是病毒分離常用的兩種方法，將病料研磨處理后，乳鼠腦內接種一定數量的DTMUV，觀察散窩、弓背、震顫、抽搐、甚至死亡等情況是否會在乳鼠身上出現，以此來判斷其是否感染。同時，可以根據發(fā)病鼠數量測定病毒的滴度。細胞接種分離法，受限于有的黃病毒產生的細胞病變不明顯，難以區(qū)別和判斷，所以分離陽性率低。在實際操作中，接種分離法經常免疫組織化學、免疫焚光、焚光定量RT-PCR等方法結使用，以此來相互印證，一般不單獨應用。無論是乳鼠腦內接種法還是細胞接種分離法，均有實驗周期長，操作繁瑣等缺點，特別是當結果為陰性時，需要進行盲傳代，以排除由于病毒量少而導致假陰性結果的可能性[53-69]。5.2.2免疫組化方法免疫組織化學（Immuno-histochemistry,IHC）又稱免疫細胞化學,簡稱免疫組化，IHC是組織化學的分支，其是在組織化學的基礎上逐漸發(fā)展起來的。為了實現對細胞或組織內的相應抗原進行定性、定位或定量檢測的目的，需要借助突光或細胞化學的手段，以抗體作為特異性染色的載體，將一些物質標記在抗體分子上，使抗原抗體復合物能夠在顯微鏡下直接觀察，其原理是利用抗原與抗體特異性結合的特點。隨著免疫組織化學技術的出現和發(fā)展，傳統(tǒng)的病理學也發(fā)生了一場翻天覆地的革命，使得純形態(tài)的病理學逐漸發(fā)展成為了現代病理學，它包括了形態(tài)與免疫信號兩部分。對鴨群進行人工鴨坦布蘇病毒攻毒后，取攻毒感染鴨的主要組織臟器，制作切片后進行免疫組織化學分析，結果在腎臟、腦、脾臟、肺臟等器官中均有黃色棕染顆粒，而明顯的陽性信號在對照組中沒有發(fā)現，這表明，鴨坦布蘇病毒存在于這些組織臟器中[20,21]。5.2.3間接免疫突光試驗間接免疫突光試驗是病毒感染快速診斷的一個重要手段，簡便、特異性強、非特異性的突光染色少是間接免疫突光試驗的最大優(yōu)點。間接免疫突光試驗利用的基本原理是將突光素與某些特異性抗體或抗原以共價鍵結合，但共價鍵的結合不影響該抗體的特異性，然后用此突光素標記的抗體對標本染色，只要標本中有相應的抗原，則突光標記的抗體與抗原結合形成抗原抗體復合物，在紫外光或激