植物組織培養(yǎng)褐變產(chǎn)生的因素及對策

植物組織培養(yǎng)褐變產(chǎn)生的因素及對策褐變在許多植物組織培養(yǎng)過程中，常遇到褐變問題。褐變主要發(fā)生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養(yǎng)以及原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)中也經(jīng)常發(fā)生。褐變產(chǎn)物不僅使外植體、細胞、培養(yǎng)基等變褐，而且對許多酶有抑制作用，從而影響培養(yǎng)材料的生長與分化，嚴重時甚至導致死亡。本文探討植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的影響因素、機理及防范措施，對我們進行科學研究或工廠生產(chǎn)，包括植物組織的培養(yǎng)原生質(zhì)體、懸浮細胞和植物器官的培養(yǎng)都有著十分重要的現(xiàn)實意義。1、褐變的危害褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中，自身組織從表面培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現(xiàn)象。褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物數(shù)量多少及多酚氧化酶活性有直接關系。很多植物，尤其是木本植物都含有較高的酚類化合物，這些酚類化合物在完整的組織和細胞中與多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩(wěn)定。在切割外植體時，切口附近的細胞受到傷害，其分割狀態(tài)被打破，酚類化合物外溢。對于外植體本身來講，酚類物質(zhì)從外植體切口向外溢出是一種自我保護性反應，可誘導植保素或無物理屏障的形成，以防止微生物浸染組織。但酚類很不穩(wěn)定，在溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌類物質(zhì)和水，醌類物質(zhì)又會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，進一步引起其他酶系統(tǒng)失活。從而導致組織代謝活動紊亂，生長停滯，最終衰老死亡。此外，由于組織的老化病變也會使多酚氧化酶激活而引起褐變。2、褐變產(chǎn)生的機理非酶促褐變非酶促褐變是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發(fā)生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。將生長正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含NaCl的培養(yǎng)基中，組織周圍尤其是接觸培養(yǎng)基部分發(fā)生褐變，但培養(yǎng)基中沒有看到擴散的褐化物質(zhì)。當溫度升高時繼代保存時間過長，也會發(fā)生此類現(xiàn)象但這種褐變?nèi)舨扇∵m當措施或者愈傷組織適應了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生了酶促褐變目前認為植物組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養(yǎng)材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的。酶促褐變?nèi)缤话愕拿复俜磻?，其發(fā)生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶PPO、過氧化物酶POD、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，表明PPO活性的高低是引起培養(yǎng)材料褐變的關鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成三類:苯基羧酸，苯丙烷衍生物，黃烷衍生物，但并非所有的酚類物質(zhì)都是PPO的底物。在正常發(fā)育的植物組織中底物、氧氣、PPO同時存在并不發(fā)生褐變，是因為在正常的組織細胞內(nèi)由于多酚類物質(zhì)分布在細胞的液泡內(nèi)，而PPO則分布在各種質(zhì)體或細胞質(zhì)中，這種區(qū)域性分布使底物與PPO不能接觸。而當細胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和破壞時，則為酶創(chuàng)造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質(zhì)氧化成醌，進行一系列的脫水、聚合反應，最后形成黑褐色物質(zhì)，從而引起褐變。3、褐變產(chǎn)生的影響因素影響植物組織培養(yǎng)褐變的因子是復雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態(tài)等不同，褐變的程度也有所不同。植物種類及基因型在不同植物或同種植物不同基因型的組培過程中，褐變發(fā)生的頻率和嚴重程度存在很大的差異，這是由于各種植物所含的單寧及其他酚類化合物的數(shù)量不同。一般木本植物的酚類化合物含量比草本植物高，更易發(fā)生褐變現(xiàn)象。核桃的單寧含量很高，不僅在接種初期發(fā)生褐變，在形成愈傷組織后還會因為褐變而死亡；蘋果進行莖尖培養(yǎng)時，不同品種之間褐變的程度也不一樣。對葡萄的研究也發(fā)現(xiàn)類似情況。外植體的生理狀態(tài)外植體的生理狀態(tài)不同，接種后褐變程度不同。一般外植體的老化程度越高，其木質(zhì)素的含量也越高，也就越容易褐變，成齡材料一般均比幼齡材料褐變嚴重。另外切口越大，酚類物質(zhì)的被氧化面也越大，褐變程度就會更嚴重。因此外植體的受傷程度對褐變的產(chǎn)生具有明顯的影響，傷口加劇褐變的發(fā)生。仙客來小葉誘導時，整片葉接種較分成多塊褐變要輕。除機械損傷外，各種消毒劑對外植體的傷害也會引起褐變，對于不易褐變的種類，用升汞消毒后，一般不會引起褐變，若用次氯酸鈉進行消毒，則很容易引起褐變的發(fā)生。取材時間和部位在不同的生長季節(jié)，植物體內(nèi)酚類化合物含量和多酚氧化酶的活性不同。實驗表明在蘋果和核桃上，冬、春季取材褐變死亡率最低，夏季取材很容易褐變。在取材部位上幼嫩莖尖比其他部位褐變程度低，木質(zhì)化程度高的節(jié)段在進行藥劑消毒處理后褐變現(xiàn)象更為嚴重。培養(yǎng)基在初代培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中無機鹽濃度過高，會引起酚類物質(zhì)大量產(chǎn)生，導致褐變。BA和KT不僅促進酚類化合物合成，而且刺激多酚氧化酶的活性，增加褐變；而生長素類如NAA和2，4-D可延緩多酚合成，減輕褐變。采用液體培養(yǎng)基紙橋培養(yǎng)；可使外植體溢出的有毒物質(zhì)很快擴散到液體培養(yǎng)基中，效果也很好。光照在采取外植體前，如果將材料或母株枝條進行遮光處理，然后再切取外植體培養(yǎng)，能夠有效地抑制褐變的發(fā)生。將接種后的初代培養(yǎng)材料在黑暗條件下培養(yǎng)，對抑制褐變發(fā)生也有一定的效果遮光抑制褐變的原因主要是由于氧化過程中，許多反應受酶系統(tǒng)控制，而酶系統(tǒng)活性受光照影響。但是，暗培養(yǎng)時間過長會降低外植體的生活能力，甚至引起死亡。溫度高溫促進酚氧化，培養(yǎng)溫度越高，褐變越嚴重，而低溫可抑制酚類化合物氧化，降低多酚氧化酶的活性，從而減輕褐變。在15-25°C下培養(yǎng)卡特蘭，比在25°C以上時褐變要輕，在17C以下培養(yǎng)天竺葵莖尖比在17-27C褐變要輕。培養(yǎng)時間材料培養(yǎng)時間過長，會引起褐變物的積累，加重對培養(yǎng)材料的傷害。蝴蝶蘭、香蕉等隨著培養(yǎng)時間的延長，褐變程度會加劇，甚至在超過一定時間不進行轉(zhuǎn)接，褐變物的積累還會引起培養(yǎng)材料的死亡。4、抑制褐變的措施從理論上講酶促褐變可以通過以下三種方法加以抑制:一是除去引起氧化的物質(zhì)——氧；二是捕捉或減少聚合反應的中間產(chǎn)物；三是抑制有關的酶。實際操作上，下列措施是被認為行之有效的。選擇適當?shù)耐庵搀w取材時應注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長，宜選用早春和秋季的材料作5為外植體。王異星用荔枝無菌苗不同組織的誘導試驗表明，莖最容易誘導出愈傷組織，培養(yǎng)2周后長出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產(chǎn)生愈傷組織或誘導出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產(chǎn)生愈傷組織，誘導出的愈傷組織全部褐變。對外植體的處理通過對較易褐變的外植體材料的預處理能減輕醌類物質(zhì)的毒害作用。處理方法如下：外植體經(jīng)流水沖洗后，在2-5C的低溫下處理12-24小時，再用升汞或70酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天，使組織中的酚類物質(zhì)部分滲入培養(yǎng)基中。取出外植體用0.1漂白粉溶液浸泡10分鐘，再接種到合適的培養(yǎng)基中。若仍有酚類物質(zhì)滲出，3-5天后再轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基2-3次，當外植體的切口愈合后，酚類物質(zhì)減少，這樣可使外植體褐變減輕或完全被抑制。用抗壞血酸預處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導率。適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)基的成分與褐變程度有關，要考慮所選培養(yǎng)基的狀態(tài)和類型。添加褐變抑制劑和吸附劑褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養(yǎng)基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產(chǎn)物醌發(fā)生作用，使其重新還原為酚。由于其作用過程均為消耗性的，在實際應用中應注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用，在生產(chǎn)應用中可不受限制。在水稻細胞的培養(yǎng)基中，添加植酸PA,可防止PA褐變，分子中眾多的羥基產(chǎn)生抗氧化作用，使生色物質(zhì)的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2結(jié)合，從而降低了其活力。陳學森等在對植酸在銀杏組織培養(yǎng)中應用的研究中也證實了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮PVP?；钚蕴渴且环N吸附性較強的無機吸附劑，能吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中的雜質(zhì)、培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中分泌的酚醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的5-羥甲基糠醛等從而有利于培養(yǎng)物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強，一般在培養(yǎng)基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過程中應注意，盡量用最低濃度的活性炭來對抗褐變的產(chǎn)生，因為活性炭的吸附作用是沒有選擇性的，在吸附物質(zhì)的同時，也會吸附培養(yǎng)基中的其他成分，對外植體的誘導分化會產(chǎn)生一定的負面影響。而聚乙烯吡咯烷酮PVP是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質(zhì)和細胞器的保護劑，可用于防止褐變。進行細胞篩選和多次轉(zhuǎn)移在組織培養(yǎng)過程中，經(jīng)常進行細胞篩選，可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天后應立即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，能減輕酚類物質(zhì)對培養(yǎng)物的毒害作用，降低抑制作用，使外植體盡快分生，連續(xù)轉(zhuǎn)移5-6次，可基本解決外植體的褐變問題。其他措施在外植體接種后1-2天即轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中或同一培養(yǎng)基的不同部位，