紫外-可見分光光度法(研2014)

§6紫外吸收光譜法

UltravioletSpectrophotometry,UV

§6.1分子吸收光譜§6.2朗伯－比爾定律§6.3紫外－可見吸收光譜儀§6.4分析條件的選擇§6.5紫外－可見吸收光譜的應(yīng)用§6.1

分子吸收光譜分子吸收光譜：分子狀態(tài)的樣品對特定波長的光進(jìn)行選擇性的吸收，根據(jù)吸收的程度進(jìn)行定性定量的方法研究物質(zhì)在紫外、可見光區(qū)（200~800nm）的分子吸收光譜的分析方法稱為紫外-可見吸收光譜法

1原理：在分子中，除了價電子相對于原子核的運動外，還有內(nèi)部原子在平衡位置的振動和分子繞其質(zhì)心的轉(zhuǎn)動。這三種運動能量都是量子化的，并對應(yīng)有一定能級，因此分子的能量為：E分子=E電子+E振動+E轉(zhuǎn)動一分子吸收光譜的產(chǎn)生§6.1.1紫外－可見吸收光譜的產(chǎn)生

2能級組成：

ΔE電子：1-20eV;ΔE振動：0.05-1eV;ΔE轉(zhuǎn)動：<0.05eV

電子能級間隔比振動能級和轉(zhuǎn)動能級間隔大1～2個數(shù)量級，在發(fā)生電子能級躍遷時，伴有振-轉(zhuǎn)能級的躍遷

由于三種能級躍遷所需能量不同，所以需要不同波長的電磁輻射使它們躍遷，即在不同的光學(xué)區(qū)出現(xiàn)吸收譜帶，形成所謂的帶狀光譜

二分子吸收光譜的分類

1轉(zhuǎn)動光譜或遠(yuǎn)紅外光譜：分子的轉(zhuǎn)動能級差一般在0.005~0.05eV，產(chǎn)生此能級的躍遷，需吸收波長約為250~25m的遠(yuǎn)紅外光

2振-轉(zhuǎn)光譜或紅外光譜：分子的振動能級差一般在0.05~1eV，需吸收波長約為25~1.25m的紅外光，在分子振動時同時有分子的轉(zhuǎn)動運動

3電子光譜或紫外、可見吸收光譜：電子能級的躍遷能差約為1~20eV，所吸收光的波長約為12.5~0.06m，主要在真空紫外到可見光區(qū)

不同物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同或者說其分子能級的能量間隔各異，因此不同物質(zhì)將選擇性地吸收不同波長或能量的外來輻射，這是UV-Vis定性分析的基礎(chǔ)

苯蒸氣的吸收曲線問題：是否所有分子都有紫外吸收？三紫外－可見吸收光譜躍遷類型價電子：σ電子→形成單鍵（頭碰頭）

π電子→形成雙鍵（肩并肩）

n電子→孤對電子(不成鍵)分子軌道理論要點（1）分子軌道理論認(rèn)為，在分子中電子不是屬于某個特定的原子，電子是在分子軌道中運動（2）分子軌道是由分子中原子的原子軌道線性組合而成，形成的分子軌道數(shù)目與組合前的原子軌道數(shù)目相等（3）原子軌道線性組合成分子軌道，分子軌道中能量高于原來原子軌道者稱為反鍵分子軌道，能量低于原來原子軌道者稱為成鍵分子軌道

原子軌道在組合成分子軌道時，要遵循對稱性匹配原則、能量相近原則和軌道最大重疊原則成鍵軌道與反鍵軌道：σ<π<n<π*<σ*不飽和化合物共軛體系化合物四相關(guān)的基本概念1吸收光譜（吸收曲線）：不同波長光對樣品作用不同，吸收強(qiáng)度不同,以A~λ作圖所得的曲線2吸收光譜特征：定性依據(jù)

吸收峰→λmax

吸收谷→λmin

肩峰→λsh

末端吸收→飽和σ-σ躍遷3生色團(tuán)（發(fā)色團(tuán)）：分子中含有非鍵或π鍵的電子體系，能吸收紫外可見光的原子基團(tuán)或結(jié)構(gòu)單元例：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—注：當(dāng)出現(xiàn)幾個發(fā)色團(tuán)共軛，則幾個發(fā)色團(tuán)所產(chǎn)生的吸收帶將消失，代之出現(xiàn)新的共軛吸收帶，其波長將比單個發(fā)色團(tuán)的吸收波長長，強(qiáng)度也增強(qiáng)4助色團(tuán):本身無紫外吸收，含有孤對電子，可使生色團(tuán)吸收峰向長波方向移動并提高吸收強(qiáng)度的一些官能團(tuán)生色團(tuán)實例溶劑max/nmmax躍遷類型烯C6H13CH=CH2正庚烷17713000→*炔C5H11C≡CCH3正庚烷17810000→*羰基CH3COCH3異辛烷27913n→*CH3COH異辛烷29017n→*羧基CH3COOH乙醇20441n→*酰胺CH3CONH2水21460n→*偶氮基CH3N=NCH3乙醇3395n→*硝基CH3NO2異辛烷28022n→*亞硝基C4H9NO乙醚300100n→*硝酸酯C2H5ONO2二氧六環(huán)27012n→*助色團(tuán)化合物溶劑max/mmax/(L.mol-1.cm-1)--CH4,C2H6氣態(tài)150,165___---OHCH3OH正己烷177200---OHC2H5OH正己烷186___---ORC2H5OC2H5氣態(tài)1901000---NH2CH3NH2--173213---NHRC2H5NHC2H5正己烷1952800---SHCH3SH乙醇1951400---SRCH3SCH3乙醇210,2291020,140---ClCH3Cl正己烷173200---BrCH3CH2CH2Br正己烷208300---ICH3I正己烷2594005紅移和藍(lán)移：由于化合物結(jié)構(gòu)變化（共軛、引入助色團(tuán)取代基）或采用不同溶劑后吸收峰位置向長波方向的移動，叫紅移（長移）吸收峰位置向短波方向移動，叫藍(lán)移（紫移，短移）6增色效應(yīng)和減色效應(yīng)增色效應(yīng)：吸收強(qiáng)度增強(qiáng)的效應(yīng)減色效應(yīng)：吸收強(qiáng)度減小的效應(yīng)7強(qiáng)帶和弱帶：

εmax>105→強(qiáng)帶;εmin<103→弱帶1飽和烴及取代烴

飽和單鍵碳?xì)浠衔锖蠧-H和C-C鍵，只含有σ鍵電子,一般在遠(yuǎn)紫外區(qū)才有吸收，又稱為真空紫外區(qū)；因為小于160nm的紫外光要被空氣中的氧所吸收，因此需要在無氧或真空中進(jìn)行測定，所以應(yīng)用不多；這類化合物在紫外吸收光譜中常用作溶劑，如己烷，庚烷，環(huán)己烷等五有機(jī)化合物的紫外－可見吸收光譜

2不飽和烴及共軛烯烴

這類化合物含有孤立雙鍵和共軛雙鍵，都含有π電子，吸收能量后可產(chǎn)生π－π*躍遷由共軛雙鍵（兩個雙鍵被一個單鍵隔開時稱為共軛體系）中躍遷產(chǎn)生的吸收帶稱為K（π－π*）帶特點：強(qiáng)度大，摩爾吸收系數(shù)大，通常在104－2×104Lmol-1cm-1，吸收峰的位置一般在217－280nm；K吸收帶的波長和強(qiáng)度與共軛體系的數(shù)目，位置和取代基的種類有關(guān)3羰基化合物（醛酮）醛酮中均含有羰基，含有n，σ和π電子，可產(chǎn)生n－σ*，π－π*和n－π*三個吸收帶，n－π*又稱為R帶，落于近紫外或紫外光區(qū)，吸收帶出現(xiàn)在270－300nm，強(qiáng)度低，吸收系數(shù)為10－20，并且譜帶略寬醛酮的羰基與雙鍵共軛時，形成不飽和醛酮類化合物，發(fā)生紅移，強(qiáng)度增強(qiáng)4苯及其取代物苯有三個吸收帶，它們都由π－π*躍遷引起的B帶：由苯環(huán)本身振動及閉合環(huán)狀共軛雙鍵π-π*躍遷而產(chǎn)生的吸收帶，是芳香族（包括雜環(huán)芳香族）的主要特征吸收帶特點：在230～270nm呈現(xiàn)一寬峰，且具有精細(xì)結(jié)構(gòu)，λmax=255nm，εmax約200，屬弱吸收,常用來識別芳香族化合物氣態(tài)或非極性溶劑中的B帶：由于振動躍遷在基態(tài)電子躍遷上的疊加有許多的精細(xì)結(jié)構(gòu)極性溶劑中的B帶：溶質(zhì)與溶劑分子的相互作用使這種精細(xì)結(jié)構(gòu)消失E吸收帶：E帶也是芳香族化合物的特征吸收譜帶，可以認(rèn)為是苯環(huán)內(nèi)三個乙烯基共軛發(fā)生的π-π*躍遷所發(fā)生的E1帶：180nm（ε＞104）E2帶：200nm（ε<7000El帶是觀察不到的，當(dāng)苯環(huán)上有生色團(tuán)取代且與苯環(huán)共軛時，E2帶常與K帶合并，吸收峰向長波移動，例如苯乙酮為苯乙酮的紫外吸收光譜,溶劑:正庚烷K帶：λmax=240nm，ε=13000B帶：λmax=278nm，ε=1100R帶：λmax=319nm，ε=505稠環(huán)及雜環(huán)化合物與苯相比，稠環(huán)芳香族化合物的紫外吸收光譜的最大特征是共軛體系增加，使波長紅移，吸收強(qiáng)度增強(qiáng)；且隨著苯環(huán)數(shù)目的增多，吸收波長紅移越多，吸收強(qiáng)度也相應(yīng)增加當(dāng)芳環(huán)上的-CH基團(tuán)被氮原子取代后，則相應(yīng)的氮雜環(huán)化合物（如吡啶、喹啉）的吸收光譜，與相應(yīng)的碳化合物極為相似，即吡啶與苯相似，喹啉與奈相似。此外，由于引入含有n電子的N原子，這類雜環(huán)化合物還可能產(chǎn)生n*吸收帶6無機(jī)化合物的紫外可見吸收光譜產(chǎn)生無機(jī)化合物紫外、可見吸收光譜的電子躍遷形式，一般分為兩大類：電荷遷移躍遷和配位場躍遷（1）電荷遷移躍遷

在配合物的中心離子和配位體中，當(dāng)一個電子由配體的軌道躍遷到與中心離子相關(guān)的軌道上時，可產(chǎn)生電荷遷移吸收光譜

不少過渡金屬離子與含生色團(tuán)的試劑反應(yīng)所生成的配合物以及許多水合無機(jī)離子，均可產(chǎn)生電荷遷移躍遷,εmax較大(104

以上)，可用于定量分析

此外，一些具有d10電子結(jié)構(gòu)的過渡元素形成的鹵化物及硫化物，如AgBr、HgS等，也是由于這類躍遷而產(chǎn)生顏色(二）配場躍遷過渡元素的d軌道或f軌道為簡并軌道，當(dāng)與配位體配合時，軌道簡并解除，d或f軌道發(fā)生能級分裂。如果軌道未充滿，則低能量軌道上的電子吸收外來能量時，將會躍遷到高能量的d或f軌道，從而產(chǎn)生吸收光譜。吸收系數(shù)εmax較小(102)，很少用于定量分析；多用于研究配合物結(jié)構(gòu)及其鍵合理論d軌道電子云分布及在配場下的分裂示意圖§6.1.2影響紫外可見吸收光譜因素一溶劑效應(yīng)1對λmax影響：

吸收帶正己烷CH3ClCH3OHH2O波長位移→*λmax/nm230238237243紅移n→*λmax/nm329315309305紫移溶劑對亞異丙基丙酮吸收帶的影響

一般來說,隨著溶劑極性增大,→*躍遷吸收峰紅移,n→*躍遷吸收峰紫移2對吸收光譜精細(xì)結(jié)構(gòu)影響

隨著溶劑極性的增大,分子振動轉(zhuǎn)動受到限制,精細(xì)結(jié)構(gòu)就會消失,合并為一條寬而低的吸收帶吸收光譜溶劑選擇依據(jù)：（1）盡量選用低極性溶劑（2）能很好地溶解被測物，并且形成的溶液具有良好的化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性

（3）溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)無明顯吸收。下表列出紫外、可見吸收光譜中常用的溶劑，以供選擇時參考溶劑使用波長范圍/nm溶劑使用波長范圍/nm水>210甘油>230乙醇>210氯仿>245甲醇>210四氯化碳>265異丙醇>210乙酸甲酯>260正丁醇>210乙酸乙酯>26096%硫酸>210乙酸正丁酯>260乙醚>220苯>280二氧六環(huán)>230甲苯>285二氯甲烷>235吡啶>303己烷>200丙酮>330環(huán)己烷>200二硫化碳>375二共軛體系的存在----紅移如CH2=CH2,λmax165~200nm

而1,3-丁二烯,λmax=217nm

由于相間的π鍵與π鍵相互作用，產(chǎn)生π－π*共軛效應(yīng)，生成大π鍵，使π*軌道的能量降低，π→π*躍遷所需的能量也減小，所以生色團(tuán)的吸收譜帶移向長波區(qū)和吸收強(qiáng)度增加共軛雙鍵數(shù)增加，紅移增大§6.2Lamber－Beer定律§6.2.1

透射比和吸光度§6.2.2

Lamber－Beer定律§6.2.3偏離Lamber－Beer定律的因素透過光的強(qiáng)度(Ⅰt)和入射光強(qiáng)度(Ⅰo)之比稱為透光度（T)：

T=Ⅰt/Ⅰo為表示物質(zhì)吸收光的程度引入吸光度(A)概念：§6.2.1

透光度和吸光度§6.2.1Lamber-Beer定律

1內(nèi)容：描述物質(zhì)對單色光吸收強(qiáng)弱(吸光度）與液層厚度和待測物濃度的關(guān)系A(chǔ)=εbc=abc(波長一定）朗伯(Lambert)像

2吸光系數(shù)（1）吸光系數(shù)的物理意義：單位濃度、單位厚度的吸光度當(dāng)b以cm,c以g/L為單位時,吸光系數(shù)以a表示:

a=A/(bc)當(dāng)b以cm,c以mol/L為單位時,摩爾吸光系數(shù)以ε表示ε=A/(bc)

（2）吸光系數(shù)的性質(zhì)

1）吸光系數(shù)與組分性質(zhì)、溫度和溶劑以及波長有關(guān)

2）吸光系數(shù)越大，物質(zhì)對光吸收能力↑,定量測定靈敏度↑

3Lamber-Beer定律討論（1）Lamber-Beer定律的適用條件（前提）入射光為單色光；溶液是稀溶液（2）該定律適用于固體、液體和氣體樣品

（3）在同一波長下各組分吸光度具有加和性

如有一復(fù)雜試樣，其中含有幾個組分，各個組分都有各自的吸光系數(shù)ε，濃度c和吸光度A，那么溶液的吸光度等于各組分的吸光度之和：

A=A1+A2+A3+…+An=ε1c1b+ε2c2b+ε3c3b+…+εncnb例1某有色溶液，用1cm比色皿時其透射比為T，如改用2cm比色皿時其透射比為多少？解例2已知某一有機(jī)化合物，在波長520nm處的摩爾吸光系數(shù)為9.29×104L/（molcm)，今用2cm的吸收池，在該波長處測得的吸光度為0.89，求有色化合物的濃度？解：c=A/εb=0.89/(9.29×104×2)=4.79×10-6§6.2.3偏離朗伯－比爾定律的因素依據(jù)Lamber-Beer定律，A與C關(guān)系應(yīng)為經(jīng)過原點的直線偏離Lamber-Beer定律的主要因素表現(xiàn)為以下兩個方面一光學(xué)因素二化學(xué)因素

A=εbc一光學(xué)因素1．非單色光的影響：Lamber-Beer定律應(yīng)用的重要前提——入射光為單色光

一般儀器所獲得的入射光是具有一定波長范圍的復(fù)合光，由于物質(zhì)對不同波長的光有不同的吸光系數(shù)，從而使得吸光度的變化偏離Lamber-Beer定律消除方法：選擇較窄的入射狹縫寬度和提高單色器分辨率決定2．雜散光的影響：

雜散光：指與測量波長相同，在儀器內(nèi)部不通過試樣而到達(dá)檢測器的那部分輻射，以及單色器通帶范圍以外的額外輻射雜散光來源：儀器本身缺陷；光學(xué)元件污染（灰塵散射，光學(xué)部件反射，散射）當(dāng)雜散光可以被試樣吸收，所得的吸光度大于真實值，出現(xiàn)正偏差；若不被吸收，吸光度小于真實值，出現(xiàn)負(fù)偏差消除辦法：提高儀器自身的性能3．反射光和散射光的影響：反射光（吸收池內(nèi)外界面間產(chǎn)生的）和散射光（顆粒較大的吸收質(zhì)點產(chǎn)生的）均是入射光譜帶寬度內(nèi)的光直接對T產(chǎn)生影響，產(chǎn)生假吸收的現(xiàn)象，使T↓，A↑，吸收光譜變形※注：一般可用空白對比校正消除4．非平行光的影響：使光程↑，A↑，吸收光譜變形二化學(xué)因素Beer定律適用的另一個前提：稀溶液；濃度過高會使C與A關(guān)系偏離定律溶質(zhì)濃度過高（>0.01mol/L),吸光物質(zhì)分子或離子間的平均距離縮小，使相鄰吸光分子的電荷分布相互影響，從而改變它對光的吸收能力，濃度越大，這種影響就越大溶質(zhì)濃度改變可能會引起其離解，締合，光化學(xué)反應(yīng)，互變異構(gòu)，絡(luò)合物配位數(shù)變化等作用，使被測組分的吸收曲線發(fā)生變化※消除辦法：采用稀溶液分析

§6.3紫外－可見吸收光譜儀器

圖3.6紫外分光光度計1：光源；2：單色器；3吸收池；4檢測器；5信號指示系統(tǒng)§

6.3.1

主要部件與性能（一）光源白熾光源：鎢燈或鹵鎢燈－可見光源350～1000nm氣體放電光源：氫燈或氘燈－紫外光源200～600nm

基本要求所需的光譜區(qū)域內(nèi)能夠發(fā)射連續(xù)輻射足夠的輻射強(qiáng)度良好的穩(wěn)定性輻射能量隨波長的變化應(yīng)盡可能?。ǘ﹩紊?單色器：能從光源輻射的復(fù)合光中分出單色光的裝置2組成：狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件（棱鏡，光柵）3棱鏡色散原理：依據(jù)不同的波長光通過棱鏡時有不同的折射率而將不同波長的光分開(1)玻璃棱鏡：由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱鏡只能用于350~3200nm的波長范圍，即只能用于可見光域內(nèi)(2)石英棱鏡：石英棱鏡可使用的波長范圍較寬，可從185~4000nm，即可用于紫外、可見和近紅外三個光域4光柵原理：利用光的衍射與干涉作用制成的范圍：紫外、可見及紅外光域，而且在整個波長區(qū)具有良好的、幾乎均勻一致的分辨能力優(yōu)點：它具有色散波長范圍寬、分辨本領(lǐng)高、成本低、便于保存和易于制備等優(yōu)點缺點：各級光譜會重疊而產(chǎn)生干擾,可用二維色散技術(shù)克服（三）吸收池1吸收池功能：用于盛放分析試樣2材料玻璃——能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)石英——不能吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)3要求：匹配性（對光的吸收和反射應(yīng)一致），為減少光的損失，吸收池的光學(xué)面必須完全垂直于光束方向（四）檢測器

1功能：檢測信號、測量單色光透過溶液后光強(qiáng)度變化的一種裝置2檢測器類型：光電池、光電管和光電倍增管3硒光電池：光的敏感范圍為300~800nm，其中500~600nm最為靈敏。一般用于低檔的分光光度計中4光電管：在紫外-可見分光光度計上應(yīng)用較為廣泛5光電倍增管：檢測微弱光最常用的光電元件，它的靈敏度比一般的光電管要高200倍，因此可使用較窄的單色器狹縫，從而對光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)有較好的分辨能力（五）信號指示系統(tǒng)作用：放大信號并以適當(dāng)方式指示或記錄下來常用裝置：直讀檢流計、電位調(diào)節(jié)指零裝置，數(shù)字顯示或自動記錄裝置§6.3.2紫外-可見吸收光譜儀的類型單光束分光光度計雙光束分光光度計雙波長分光光度計特點：使用時來回拉動吸收池（輪流通過參比溶液和樣品溶液）→移動誤差結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，維修容易（一）單光束分光光度計光電倍增管斬波器光閘試樣單色器單光束分光光度計原理圖（二）雙光束分光光度計特點：不用拉動吸收池，可以減小移動誤差;可以自動掃描吸收光譜（三）雙波長分光光度計

特點：定量基礎(chǔ)：ΔA=(ε1-ε2)bC；可消除干擾和吸收池不匹配引起的誤差，不需要參比溶液；適用于分析多組分混合物，混濁試樣（如生物組織液）§6.4分析條件的選擇儀器測量條件的選擇顯色反應(yīng)條件的選擇一儀器測量條件的選擇

1入射光波長的選擇：入射光的波長對測定結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度都有很大的影響，一般用最大吸收波長，如有干擾則選用其他波長2吸光度讀數(shù)范圍的選擇：吸光度讀數(shù)誤差是常數(shù)，但不同讀數(shù)范圍誤差不同；通?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)溶液濃度或改變光程b來控制A的讀數(shù)在

0.15-1.00

范圍內(nèi)，此時吸光度讀數(shù)誤差最小3參比溶液：又稱空白溶液，在光度分析法中，利用參比溶液調(diào)節(jié)儀器的吸光度零點、消除顯色溶液中其他有色物質(zhì)的干擾，抵消比色皿壁及溶液對入射光的反射和吸收的影響等二顯色反應(yīng)條件的選擇（一）顯色反應(yīng)和顯色劑1顯色反應(yīng)：被測元素（金屬離子）在某種試劑作用下,轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔锏姆磻?yīng)2顯色劑：所用的試劑3對顯色反應(yīng)的要求:（1）選擇性好（2）靈敏度要高（3）有色配合物的組成一定并且穩(wěn)定（二）影響顯色反應(yīng)的條件1顯色劑用量：配位數(shù)與顯色劑用量有關(guān)；在形成逐級配合物，其用量更要嚴(yán)格控制2溶液酸度：配位數(shù)和水解等與pH有關(guān)3顯色時間、溫度、放置時間通過條件實驗確定顯色反應(yīng)條件pH范圍配合物組成顏色<4Fe(C7H4O3)+紫紅色(1:1)4-7Fe