LCNMR原理和開展歷程課件

HPLC-NMR聯用技術2021/8/231最新PPT可修改歡迎下載目錄一、HPLC-NMR出現的意義二、HPLC-NMR的發(fā)展進程三、HPLC-NMR裝置四、HPLC-NMR在實際應用中面臨的主要技術問題及解決方法五、操作模式和技術六、HPLC-NMR的應用七、HPLC-NMR的前景展望2021/8/232最新PPT可修改歡迎下載一、HPLC-NMR出現的意義高效液相色譜是分析復雜有機物、藥物和生物大分子等混合物的一種重要手段,但如果使用通常的檢測器如紫外、熒光、電化學等檢測器只能得到非常有限的分子結構信息。NMR能夠提供大量的分子結構信息，但NMR分析方法要求樣品為純品，對于復雜的混合物，因為NMR信號的互相覆蓋，單純靠NMR譜則顯得無能為力。

如果在核磁儀器前加上一級色譜分離設備把直接樣品分離后再送人NMR中掃描，就可以大大簡化分析程序，提高樣品分析速度，這就是色譜分離技術與NMR波譜儀結合并且日趨普及的原因。2021/8/233最新PPT可修改歡迎下載二、HPLC-NMR的發(fā)展進程在70年代末，第一次有人將HPLC-NMR聯用80年代末HPLC-NMR技術才作為一種有效的分析手段而得到了承認最近幾年HPLC-NMR的分析方法迅速發(fā)展并取得了巨大的成功，已經被證明為生物化學和藥物化學分析中最重要的分子結構鑒定方法之一2021/8/234最新PPT可修改歡迎下載

三、HPLC-NMR的裝置典型的HPLC—NMR聯用裝置是由泵、注入閥、色譜柱和紫外檢測器組成LC系統(tǒng)，通過一條2～2.5m長的特制毛細管連接到NMR液相探頭上?？梢詫MR視為HPLC的特殊檢測器，其化學位移、積分強度和譜線分裂情況能提供豐富的定量定性信息。位于NMR探頭底部的閥用來控制NMR測試是在停流狀態(tài)下還是在連續(xù)流動狀態(tài)下進行。2021/8/235最新PPT可修改歡迎下載NMR探頭是聯用裝置中最關鍵的部分。傳統(tǒng)的NMR探頭樣品管在一個與測量線圈相連的玻璃插件內旋轉。HPLC-NMR探頭由一個不旋轉的直接固定在射頻線圈上的玻璃管構成，它處于傳統(tǒng)探頭玻璃杜瓦瓶的中心，玻璃管內徑為2，3或4mm。玻璃壁長度至少超過質子檢測線圈(18mm)，并與之平行，同時向兩端逐漸變細。由于射頻線圈直接固定在檢測池的玻璃管上，NMR線圈的體積與試樣體積比，即所謂的填充因子(fillingfactor)接近最佳值，這種類型的NMR測定探頭原則上是最靈敏的。2021/8/236最新PPT可修改歡迎下載（一）HPLC高濃度溶劑的NMR信號抑制首先，大多數HPLC體系采用反相柱，兩元或三元體系作為流動相，這些強溶劑峰使得被分析成分的NMR信號變差，且強的溶劑峰所伴隨的13C衛(wèi)星峰也會干擾有用信號的觀測。其次，實驗過程中流動相溶劑梯度會引起某些溶劑峰化學位移的移動。

四、HPLC-NMR在實際應用中面臨的主要技術問題及解決方法2021/8/237最新PPT可修改歡迎下載常用的方法有：采用氘代溶劑，價格昂貴，但近年來由于毛細管HPLC的發(fā)展，溶劑的消耗量大為減少，實驗中有可能使用氘代試劑作洗脫液，不必使用溶劑抑制。通過不同頻率通道進行多重溶劑峰預飽和。脈沖梯度場的相位離散而消除溶劑干擾。使用WET-序列。2021/8/238最新PPT可修改歡迎下載（二）避免損害色譜分析的分辨率與HPLC的常規(guī)用量相比，NMR檢測所需的樣品量是非常大的。在HPLC-NMR操作中，較大的HPLC進樣量和較長的HPLC流動時間實際上造成了色譜峰的展寬。理想的進樣量應該是盡可能小地來取得好的HPLC分辨率，同時又應該盡可能大地來滿足NMR檢測的需要。這個問題可以通過選擇最佳進樣量及優(yōu)化其它操作條件來部分地解決。2021/8/239最新PPT可修改歡迎下載（三）NMR高靈敏度的需要

NMR的靈敏度大大低于HPLC的其它常規(guī)檢測器(如：紫外檢測器等)靈敏度，如何解決這個矛盾是HPLC-NMR技術發(fā)展的主要難題之一。高場探頭性能的不斷改進，大大提高了NMR的檢測靈敏度，除此外，目前還可采取四個個途徑：

(1)采取適當的操作方式。（后續(xù)講述）例如采用駐流方式可以大大提高系統(tǒng)的靈敏度。

(2)使用高頻儀器。隨著NMR技術的發(fā)展，儀器的頻率在不斷的提高，現在已出現了800MHz以上的儀器，靈敏度較以往的儀器有了大幅度的提高。2021/8/2310最新PPT可修改歡迎下載(3)利用SPC等方法濃縮樣品超臨界流體是指處于臨界溫度、臨界壓力狀態(tài)下的物質，這時其物理性質介于氣體和液體之間。超臨界流體技術能夠彌補氣相和液相分離存在的缺點，且能兼顧兩者的優(yōu)點。作為流動相的CO2具有價廉、安全和易獲取等優(yōu)點，對低極性或中極性物質具有較好的溶解性，適合分析熱敏感組分。同時，作為流動相的CO2

沒有氫信號，因而不需要考慮水峰抑制問題?？梢砸淮涡酝瓿蓮臉悠返姆蛛x純化到蜂的檢測、結構測定和定量分析，并提供混合物的組成和結構信息，從而提高了研究效率和靈活性。2021/8/2311最新PPT可修改歡迎下載(4)降低探頭溫度利用高溫超導薄膜材料而制成的超導低溫探頭，當樣品溫度由溫控單元維持時，采用閉環(huán)或開環(huán)制冷系統(tǒng)使超導線圈溫度降到25K，消除了譜圖的電噪聲，這相對于常規(guī)5mm探頭而言，其潛在靈敏度可以提高8～10倍。2021/8/2312最新PPT可修改歡迎下載總的來看，目前HPLC-NMR主要有兩種可供選擇的操作方式，分別是連續(xù)流方式和駐流方式。其中駐流方式又主要分為時間分割駐流方式、脫機駐流方式和uv檢測自動控制NMR取樣。下面對其進行一一詳細討論。五、操作模式和技術2021/8/2313最新PPT可修改歡迎下載（1）連續(xù)流動模式HPLC的流動是連續(xù)的，不受NMR取樣的影響，當每一組分由HPLC流經NMR檢測池時儀器時就會掃描出這個組分的譜圖。使用這種方法可以在很短的時間內完成樣品分析并得到各組分分子結構方面的信息。因此連續(xù)流操作方式在一些要求較快得出檢測結果的分析中得到了應用。但是這種模式一般只適用于1H和19F測試。2021/8/2314最新PPT可修改歡迎下載（2）駐流模式：駐流模式：讓溶液停留于檢測池中進行測試，當所需要組分的保留時間已知，或者HPLC—NMR采用靈敏的在線檢測器時，可以采用這種方法。①時間分割駐流方式。這是最早使用的一種駐流操作方式。具體方法是：通過紫外檢測器確定了色譜峰位置之后，在適當的時間停止色譜流動，使色譜峰準確地停留在NMR檢測池中，同時使用NMR進行較長時間的掃描(可達數小時)，并且根據需要可以作COSY、TOCSY等二維NMR譜圖。一個譜峰掃描完畢后，可以繼續(xù)色譜流動。這樣就相當于將整個色譜流動過程分為若干段，一段段地進行NMR分析。

就目前來看，這種操作方式的主要缺點是：由于色譜流動相階段性停止，大大增加了分離時間，從而可能會使色譜峰展寬，分辨率下降。2021/8/2315最新PPT可修改歡迎下載②脫機駐流方式脫機駐流操作方法是在色譜分離的過程中，將各個色譜峰的一部分轉移到不同毛細管(capillaryloops)中．然后再分別進人NMR檢測池進行掃描分析。在整個過程中，色譜峰并沒有任何停頓，所以就解決了使用“時間分割”駐流方式所帶來的色譜峰展寬問題。2021/8/2316最新PPT可修改歡迎下載③UV檢測器控制NMR取樣使用這種方式進行操作必須有相應的軟件支持。在這種操作方式中，可以選擇手動和自動兩種模式。當選用自動方式時，系統(tǒng)會通過UV檢測器監(jiān)測HPLC流出的較大色譜峰，并自動取樣進人NMR中進行掃描。如果選用手動方式，儀器可按用戶設置的峰位置、大小等參數有選擇地對各組分進行取樣、掃描。

這種操作方法自動化程度高，使用簡便，目前正處于發(fā)展之中。2021/8/2317最新PPT可修改歡迎下載六、HPLC-NMR的應用HPLC-NMR在藥物研究中的應用主要是新藥雜質(副反應產物與降解產物)結構測定、植物提取物中具生理活性化合物的結構測定、藥物構型研究、藥物代謝產物的結構與構型研究、藥物在體液中的毒性與藥代動力學研究以及微生物代謝物研究。2021/8/2318最新PPT可修改歡迎下載（一）在藥物代謝研究中的應用P．Foxall等用HPLC—NMR研究了異環(huán)磷酰胺的毒性和代謝物。用1H—NMR觀察尿液中各種指標的變化，包括尿糖、甘氨酸、丙氨酸、組胺酸、乳酸、乙酸鹽、三甲胺丁二酸鹽的上升和馬尿酸鹽、檸檬酸鹽的下降。結合31P—NMR譜，鑒定出3種代謝物。用BrukerDKX500NMR儀，NMR探頭體積120L，測1H譜時用門控預飽和技術來達到水和乙腈雙溶劑抑制。2021/8/2319最新PPT可修改歡迎下載（二）在天然產物化學中的應用在線或收集分析鑒定混合物結構J．D．Koning等以在線痕量富集HPLC—NMR鑒定了蛇麻草提取物中蛇麻草苦昧酸。Y．Zhao等用停流HPLC—NMR研究了紫杉科植物提取物的成分，分離并鑒定出7種木酚素。2021/8/2320最新PPT可修改歡迎下載（三）在食品化學中的應用采用HPLC—NMR技術鑒別食品中有關成分，作為質量控制、品質評定應用于食品中糖類(酒、果汁)、水質、保健食品等分析。

I．Duarte等¨應用LC—NMR／MS技術測定了啤酒中糖類物質，糖類物質的結構由NMR單獨來確定時，會產生嚴重的峰重疊，而采用LC—NMR／MS則能夠快速測定糊精單體的聚合程度。A．1~mmen等馴利用HPLC—NMR—MS技術確認蘋果皮中槲皮素糖苷、根皮素糖苷的含量。2021/8/2321最新PPT可修改歡迎下載（四）在雜質研究中的應用Mistry等j用HPLC-NMR確定了氟替卡松丙酸鹽4個已知的二聚體雜質，雜質存在水平為0．06％一0．9％。HPLC條件為BrukerLC22泵，可變波長紫外檢測器(239nm檢測)，InertsilODS-2色譜柱、柱溫40℃，NMR條件為BrokerAMX-6OONMR儀、NMR探頭內徑mm、體積20μL和用脈沖序列抑制溶劑峰信號。2021/8/2322最新PPT可修改歡迎下載此外，HPLC-NMR聯用技術在生物分析、環(huán)境監(jiān)測、微生物代謝物研究等方面也有應用。2021/8/2323最新PPT可修改歡迎下載HPLC—NMR聯用技術解決了醫(yī)藥、聚合物和生物醫(yī)學不同領域的實際問題。其關鍵在于巧妙而完美的聯用技術,這種聯用技術包括適當的接口技術，其要兼顧HPLC和NMR各組成部分的性能和參數的最佳化，從而使整個系統(tǒng)更為實用更為完美。通過優(yōu)化連續(xù)流動探頭的設計，可進一步降低NMR的檢測限；通過脈沖梯度場相關的溶劑抑制技術，可獲得更好的抑制效果；通過設計更合理的螺線式檢測線圈的流動腔，NMR信號的分辨率可望達到0.5Hz的水平。隨著各種功能的日趨完善，其應用范圍將不斷擴大，從而進一步發(fā)揮其潛在能力和應用價值可以預計在不久的將來，在線HPLC-NMR聯用系統(tǒng)將成為中等大小分子的各種有機化合物分離和分析的最有效手段之一。七、HPLC-NMR的前景展望2021/8/2324最新PPT可修改歡迎下載Thankyou!2021/8/2325最新PPT可修改歡迎下載1、最困難的事就是認識自己。20.6.286.28.202020:1120:11:15Jun-2020:11

2、自知之明是最難得的知識。二〇二〇年六月二十八日2020年6月28日星期日

3、越是無能的人，越喜歡挑剔別人。20:116.28.202020:116.28.202020:1120:11:156.28.202020:116.28.2020

4、與肝膽人共事，無字句處讀書。6.28.20206.28.202020:1120:1120:11:1520:11:15

5、三軍可奪帥也。Sunday,June28,2020June20Sunday,June28,20206/28/2020

6、最大的驕傲于最大的自卑都表示心靈的最軟弱無力。8時11分8時11分28-Jun-206.28.2020

7、人生就是學校。20.6.2820.6.2820.6.28。2020年6月28日星期日二〇二〇年六月二十八日

8、你讓愛生命嗎，那么不要浪費時