LCNMR原理和開展歷程課件

HPLC-NMR聯(lián)用技術(shù)2021/8/231最新PPT可修改歡迎下載目錄一、HPLC-NMR出現(xiàn)的意義二、HPLC-NMR的發(fā)展進(jìn)程三、HPLC-NMR裝置四、HPLC-NMR在實(shí)際應(yīng)用中面臨的主要技術(shù)問題及解決方法五、操作模式和技術(shù)六、HPLC-NMR的應(yīng)用七、HPLC-NMR的前景展望2021/8/232最新PPT可修改歡迎下載一、HPLC-NMR出現(xiàn)的意義高效液相色譜是分析復(fù)雜有機(jī)物、藥物和生物大分子等混合物的一種重要手段,但如果使用通常的檢測器如紫外、熒光、電化學(xué)等檢測器只能得到非常有限的分子結(jié)構(gòu)信息。NMR能夠提供大量的分子結(jié)構(gòu)信息，但NMR分析方法要求樣品為純品，對于復(fù)雜的混合物，因?yàn)镹MR信號的互相覆蓋，單純靠NMR譜則顯得無能為力。

如果在核磁儀器前加上一級色譜分離設(shè)備把直接樣品分離后再送人NMR中掃描，就可以大大簡化分析程序，提高樣品分析速度，這就是色譜分離技術(shù)與NMR波譜儀結(jié)合并且日趨普及的原因。2021/8/233最新PPT可修改歡迎下載二、HPLC-NMR的發(fā)展進(jìn)程在70年代末，第一次有人將HPLC-NMR聯(lián)用80年代末HPLC-NMR技術(shù)才作為一種有效的分析手段而得到了承認(rèn)最近幾年HPLC-NMR的分析方法迅速發(fā)展并取得了巨大的成功，已經(jīng)被證明為生物化學(xué)和藥物化學(xué)分析中最重要的分子結(jié)構(gòu)鑒定方法之一2021/8/234最新PPT可修改歡迎下載

三、HPLC-NMR的裝置典型的HPLC—NMR聯(lián)用裝置是由泵、注入閥、色譜柱和紫外檢測器組成LC系統(tǒng)，通過一條2～2.5m長的特制毛細(xì)管連接到NMR液相探頭上?？梢詫MR視為HPLC的特殊檢測器，其化學(xué)位移、積分強(qiáng)度和譜線分裂情況能提供豐富的定量定性信息。位于NMR探頭底部的閥用來控制NMR測試是在停流狀態(tài)下還是在連續(xù)流動(dòng)狀態(tài)下進(jìn)行。2021/8/235最新PPT可修改歡迎下載NMR探頭是聯(lián)用裝置中最關(guān)鍵的部分。傳統(tǒng)的NMR探頭樣品管在一個(gè)與測量線圈相連的玻璃插件內(nèi)旋轉(zhuǎn)。HPLC-NMR探頭由一個(gè)不旋轉(zhuǎn)的直接固定在射頻線圈上的玻璃管構(gòu)成，它處于傳統(tǒng)探頭玻璃杜瓦瓶的中心，玻璃管內(nèi)徑為2，3或4mm。玻璃壁長度至少超過質(zhì)子檢測線圈(18mm)，并與之平行，同時(shí)向兩端逐漸變細(xì)。由于射頻線圈直接固定在檢測池的玻璃管上，NMR線圈的體積與試樣體積比，即所謂的填充因子(fillingfactor)接近最佳值，這種類型的NMR測定探頭原則上是最靈敏的。2021/8/236最新PPT可修改歡迎下載（一）HPLC高濃度溶劑的NMR信號抑制首先，大多數(shù)HPLC體系采用反相柱，兩元或三元體系作為流動(dòng)相，這些強(qiáng)溶劑峰使得被分析成分的NMR信號變差，且強(qiáng)的溶劑峰所伴隨的13C衛(wèi)星峰也會干擾有用信號的觀測。其次，實(shí)驗(yàn)過程中流動(dòng)相溶劑梯度會引起某些溶劑峰化學(xué)位移的移動(dòng)。

四、HPLC-NMR在實(shí)際應(yīng)用中面臨的主要技術(shù)問題及解決方法2021/8/237最新PPT可修改歡迎下載常用的方法有：采用氘代溶劑，價(jià)格昂貴，但近年來由于毛細(xì)管HPLC的發(fā)展，溶劑的消耗量大為減少，實(shí)驗(yàn)中有可能使用氘代試劑作洗脫液，不必使用溶劑抑制。通過不同頻率通道進(jìn)行多重溶劑峰預(yù)飽和。脈沖梯度場的相位離散而消除溶劑干擾。使用WET-序列。2021/8/238最新PPT可修改歡迎下載（二）避免損害色譜分析的分辨率與HPLC的常規(guī)用量相比，NMR檢測所需的樣品量是非常大的。在HPLC-NMR操作中，較大的HPLC進(jìn)樣量和較長的HPLC流動(dòng)時(shí)間實(shí)際上造成了色譜峰的展寬。理想的進(jìn)樣量應(yīng)該是盡可能小地來取得好的HPLC分辨率，同時(shí)又應(yīng)該盡可能大地來滿足NMR檢測的需要。這個(gè)問題可以通過選擇最佳進(jìn)樣量及優(yōu)化其它操作條件來部分地解決。2021/8/239最新PPT可修改歡迎下載（三）NMR高靈敏度的需要

NMR的靈敏度大大低于HPLC的其它常規(guī)檢測器(如：紫外檢測器等)靈敏度，如何解決這個(gè)矛盾是HPLC-NMR技術(shù)發(fā)展的主要難題之一。高場探頭性能的不斷改進(jìn)，大大提高了NMR的檢測靈敏度，除此外，目前還可采取四個(gè)個(gè)途徑：

(1)采取適當(dāng)?shù)牟僮鞣绞?。（后續(xù)講述）例如采用駐流方式可以大大提高系統(tǒng)的靈敏度。

(2)使用高頻儀器。隨著NMR技術(shù)的發(fā)展，儀器的頻率在不斷的提高，現(xiàn)在已出現(xiàn)了800MHz以上的儀器，靈敏度較以往的儀器有了大幅度的提高。2021/8/2310最新PPT可修改歡迎下載(3)利用SPC等方法濃縮樣品超臨界流體是指處于臨界溫度、臨界壓力狀態(tài)下的物質(zhì)，這時(shí)其物理性質(zhì)介于氣體和液體之間。超臨界流體技術(shù)能夠彌補(bǔ)氣相和液相分離存在的缺點(diǎn)，且能兼顧兩者的優(yōu)點(diǎn)。作為流動(dòng)相的CO2具有價(jià)廉、安全和易獲取等優(yōu)點(diǎn)，對低極性或中極性物質(zhì)具有較好的溶解性，適合分析熱敏感組分。同時(shí)，作為流動(dòng)相的CO2

沒有氫信號，因而不需要考慮水峰抑制問題?？梢砸淮涡酝瓿蓮臉悠返姆蛛x純化到蜂的檢測、結(jié)構(gòu)測定和定量分析，并提供混合物的組成和結(jié)構(gòu)信息，從而提高了研究效率和靈活性。2021/8/2311最新PPT可修改歡迎下載(4)降低探頭溫度利用高溫超導(dǎo)薄膜材料而制成的超導(dǎo)低溫探頭，當(dāng)樣品溫度由溫控單元維持時(shí)，采用閉環(huán)或開環(huán)制冷系統(tǒng)使超導(dǎo)線圈溫度降到25K，消除了譜圖的電噪聲，這相對于常規(guī)5mm探頭而言，其潛在靈敏度可以提高8～10倍。2021/8/2312最新PPT可修改歡迎下載總的來看，目前HPLC-NMR主要有兩種可供選擇的操作方式，分別是連續(xù)流方式和駐流方式。其中駐流方式又主要分為時(shí)間分割駐流方式、脫機(jī)駐流方式和uv檢測自動(dòng)控制NMR取樣。下面對其進(jìn)行一一詳細(xì)討論。五、操作模式和技術(shù)2021/8/2313最新PPT可修改歡迎下載（1）連續(xù)流動(dòng)模式HPLC的流動(dòng)是連續(xù)的，不受NMR取樣的影響，當(dāng)每一組分由HPLC流經(jīng)NMR檢測池時(shí)儀器時(shí)就會掃描出這個(gè)組分的譜圖。使用這種方法可以在很短的時(shí)間內(nèi)完成樣品分析并得到各組分分子結(jié)構(gòu)方面的信息。因此連續(xù)流操作方式在一些要求較快得出檢測結(jié)果的分析中得到了應(yīng)用。但是這種模式一般只適用于1H和19F測試。2021/8/2314最新PPT可修改歡迎下載（2）駐流模式：駐流模式：讓溶液停留于檢測池中進(jìn)行測試，當(dāng)所需要組分的保留時(shí)間已知，或者HPLC—NMR采用靈敏的在線檢測器時(shí)，可以采用這種方法。①時(shí)間分割駐流方式。這是最早使用的一種駐流操作方式。具體方法是：通過紫外檢測器確定了色譜峰位置之后，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間停止色譜流動(dòng)，使色譜峰準(zhǔn)確地停留在NMR檢測池中，同時(shí)使用NMR進(jìn)行較長時(shí)間的掃描(可達(dá)數(shù)小時(shí))，并且根據(jù)需要可以作COSY、TOCSY等二維NMR譜圖。一個(gè)譜峰掃描完畢后，可以繼續(xù)色譜流動(dòng)。這樣就相當(dāng)于將整個(gè)色譜流動(dòng)過程分為若干段，一段段地進(jìn)行NMR分析。

就目前來看，這種操作方式的主要缺點(diǎn)是：由于色譜流動(dòng)相階段性停止，大大增加了分離時(shí)間，從而可能會使色譜峰展寬，分辨率下降。2021/8/2315最新PPT可修改歡迎下載②脫機(jī)駐流方式脫機(jī)駐流操作方法是在色譜分離的過程中，將各個(gè)色譜峰的一部分轉(zhuǎn)移到不同毛細(xì)管(capillaryloops)中．然后再分別進(jìn)人NMR檢測池進(jìn)行掃描分析。在整個(gè)過程中，色譜峰并沒有任何停頓，所以就解決了使用“時(shí)間分割”駐流方式所帶來的色譜峰展寬問題。2021/8/2316最新PPT可修改歡迎下載③UV檢測器控制NMR取樣使用這種方式進(jìn)行操作必須有相應(yīng)的軟件支持。在這種操作方式中，可以選擇手動(dòng)和自動(dòng)兩種模式。當(dāng)選用自動(dòng)方式時(shí)，系統(tǒng)會通過UV檢測器監(jiān)測HPLC流出的較大色譜峰，并自動(dòng)取樣進(jìn)人NMR中進(jìn)行掃描。如果選用手動(dòng)方式，儀器可按用戶設(shè)置的峰位置、大小等參數(shù)有選擇地對各組分進(jìn)行取樣、掃描。

這種操作方法自動(dòng)化程度高，使用簡便，目前正處于發(fā)展之中。2021/8/2317最新PPT可修改歡迎下載六、HPLC-NMR的應(yīng)用HPLC-NMR在藥物研究中的應(yīng)用主要是新藥雜質(zhì)(副反應(yīng)產(chǎn)物與降解產(chǎn)物)結(jié)構(gòu)測定、植物提取物中具生理活性化合物的結(jié)構(gòu)測定、藥物構(gòu)型研究、藥物代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與構(gòu)型研究、藥物在體液中的毒性與藥代動(dòng)力學(xué)研究以及微生物代謝物研究。2021/8/2318最新PPT可修改歡迎下載（一）在藥物代謝研究中的應(yīng)用P．Foxall等用HPLC—NMR研究了異環(huán)磷酰胺的毒性和代謝物。用1H—NMR觀察尿液中各種指標(biāo)的變化，包括尿糖、甘氨酸、丙氨酸、組胺酸、乳酸、乙酸鹽、三甲胺丁二酸鹽的上升和馬尿酸鹽、檸檬酸鹽的下降。結(jié)合31P—NMR譜，鑒定出3種代謝物。用BrukerDKX500NMR儀，NMR探頭體積120L，測1H譜時(shí)用門控預(yù)飽和技術(shù)來達(dá)到水和乙腈雙溶劑抑制。2021/8/2319最新PPT可修改歡迎下載（二）在天然產(chǎn)物化學(xué)中的應(yīng)用在線或收集分析鑒定混合物結(jié)構(gòu)J．D．Koning等以在線痕量富集HPLC—NMR鑒定了蛇麻草提取物中蛇麻草苦昧酸。Y．Zhao等用停流HPLC—NMR研究了紫杉科植物提取物的成分，分離并鑒定出7種木酚素。2021/8/2320最新PPT可修改歡迎下載（三）在食品化學(xué)中的應(yīng)用采用HPLC—NMR技術(shù)鑒別食品中有關(guān)成分，作為質(zhì)量控制、品質(zhì)評定應(yīng)用于食品中糖類(酒、果汁)、水質(zhì)、保健食品等分析。

I．Duarte等¨應(yīng)用LC—NMR／MS技術(shù)測定了啤酒中糖類物質(zhì)，糖類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)由NMR單獨(dú)來確定時(shí)，會產(chǎn)生嚴(yán)重的峰重疊，而采用LC—NMR／MS則能夠快速測定糊精單體的聚合程度。A．1~mmen等馴利用HPLC—NMR—MS技術(shù)確認(rèn)蘋果皮中槲皮素糖苷、根皮素糖苷的含量。2021/8/2321最新PPT可修改歡迎下載（四）在雜質(zhì)研究中的應(yīng)用Mistry等j用HPLC-NMR確定了氟替卡松丙酸鹽4個(gè)已知的二聚體雜質(zhì)，雜質(zhì)存在水平為0．06％一0．9％。HPLC條件為BrukerLC22泵，可變波長紫外檢測器(239nm檢測)，InertsilODS-2色譜柱、柱溫40℃，NMR條件為BrokerAMX-6OONMR儀、NMR探頭內(nèi)徑mm、體積20μL和用脈沖序列抑制溶劑峰信號。2021/8/2322最新PPT可修改歡迎下載此外，HPLC-NMR聯(lián)用技術(shù)在生物分析、環(huán)境監(jiān)測、微生物代謝物研究等方面也有應(yīng)用。2021/8/2323最新PPT可修改歡迎下載HPLC—NMR聯(lián)用技術(shù)解決了醫(yī)藥、聚合物和生物醫(yī)學(xué)不同領(lǐng)域的實(shí)際問題。其關(guān)鍵在于巧妙而完美的聯(lián)用技術(shù),這種聯(lián)用技術(shù)包括適當(dāng)?shù)慕涌诩夹g(shù)，其要兼顧HPLC和NMR各組成部分的性能和參數(shù)的最佳化，從而使整個(gè)系統(tǒng)更為實(shí)用更為完美。通過優(yōu)化連續(xù)流動(dòng)探頭的設(shè)計(jì)，可進(jìn)一步降低NMR的檢測限；通過脈沖梯度場相關(guān)的溶劑抑制技術(shù)，可獲得更好的抑制效果；通過設(shè)計(jì)更合理的螺線式檢測線圈的流動(dòng)腔，NMR信號的分辨率可望達(dá)到0.5Hz的水平。隨著各種功能的日趨完善，其應(yīng)用范圍將不斷擴(kuò)大，從而進(jìn)一步發(fā)揮其潛在能力和應(yīng)用價(jià)值可以預(yù)計(jì)在不久的將來，在線HPLC-NMR聯(lián)用系統(tǒng)將成為中等大小分子的各種有機(jī)化合物分離和分析的最有效手段之一。七、HPLC-NMR的前景展望2021/8/2324最新PPT可修改歡迎下載Thankyou!2021/8/2325最新PPT可修改歡迎下載1、最困難的事就是認(rèn)識自己。20.6.286.28.202020:1120:11:15Jun-2020:11

2、自知之明是最難得的知識。二〇二〇年六月二十八日2020年6月28日星期日

3、越是無能的人，越喜歡挑剔別人。20:116.28.202020:116.28.202020:1120:11:156.28.202020:116.28.2020

4、與肝膽人共事，無字句處讀書。6.28.20206.28.202020:1120:1120:11:1520:11:15

5、三軍可奪帥也。Sunday,June28,2020June20Sunday,June28,20206/28/2020

6、最大的驕傲于最大的自卑都表示心靈的最軟弱無力。8時(shí)11分8時(shí)11分28-Jun-206.28.2020

7、人生就是學(xué)校。20.6.2820.6.2820.6.28。2020年6月28日星期日二〇二〇年六月二十八日

8、你讓愛生命嗎，那么不要浪費(fèi)時(shí)