第十二章發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制

第十二章產(chǎn)物的提取與精制第一節(jié)概論一、下游加工過(guò)程在發(fā)酵工程中的地位1.下游加工過(guò)程的定義發(fā)酵產(chǎn)品系通過(guò)微生物發(fā)酵過(guò)程、酶反應(yīng)過(guò)程或動(dòng)植物細(xì)胞大量培養(yǎng)獲得。從上述發(fā)酵液、反應(yīng)液或培養(yǎng)液中分離、精制有關(guān)產(chǎn)品的過(guò)程稱為下游加工過(guò)程(Downstreamprocessing)。

2.地位二、發(fā)酵下游加工過(guò)程的特點(diǎn)培養(yǎng)液(或發(fā)酵液)是復(fù)雜的多相系統(tǒng)培養(yǎng)液中所欲提取的生物物質(zhì)濃度很低，雜質(zhì)含量很高

欲提取的生物物質(zhì)通常很不穩(wěn)定、遇熱、極端pH、有機(jī)溶劑會(huì)引起失活或分解。

發(fā)酵或培養(yǎng)都是分批操作、生物變異性大，各批發(fā)酵液不盡相同，要求下游加工有一定的彈性。三、分離過(guò)程的機(jī)理與分離操作1.物理性質(zhì)（1）力學(xué)性質(zhì)：重力、離心力、篩分（2）熱力學(xué)性質(zhì)：狀態(tài)變化、相平衡（3）傳質(zhì)性質(zhì)：粘度、擴(kuò)散、熱擴(kuò)散（4）電磁性質(zhì)：電泳、電滲析、磁化2.化學(xué)性質(zhì)（1）化學(xué)熱力學(xué)；化學(xué)平衡（2）反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：反應(yīng)速率（3）光化學(xué)性質(zhì)：激光激發(fā)、離子化3.生物學(xué)性質(zhì)（1）分子識(shí)別：生物親和作用、生物學(xué)識(shí)別（2）輸送性質(zhì)：生物膜輸送（3）反應(yīng)、響應(yīng)、控制：酶反應(yīng)、免疫系統(tǒng)生物操作機(jī)理及其分離機(jī)理單元操作分離機(jī)理分離對(duì)象舉例膜分離微濾超濾反滲透透析電滲析滲透氣化壓力差、篩分壓力差、篩分壓力差、篩分濃度差、篩分電荷、篩分汽液相平衡、篩分菌體、細(xì)胞蛋白質(zhì)、多糖、抗生素糖、氨基酸鹽、蛋白質(zhì)氨基酸、有機(jī)酸乙醇萃取有機(jī)溶劑萃取雙水相液膜萃取反膠團(tuán)萃取超臨界萃取液液相平衡液液相平衡液液相平衡液液相平衡相平衡有機(jī)酸、抗生素蛋白質(zhì)、抗生素氨基酸、有機(jī)酸、抗生素氨基酸、蛋白質(zhì)香料、脂質(zhì)萃取有機(jī)溶劑萃取雙水相液膜萃取反膠團(tuán)萃取超臨界萃取液液相平衡液液相平衡液液相平衡液液相平衡相平衡有機(jī)酸、抗生素蛋白質(zhì)、抗生素氨基酸、有機(jī)酸、抗生素氨基酸、蛋白質(zhì)香料、脂質(zhì)層析凝膠過(guò)濾層析反相層析離子交換層析親和層析疏水相互作用層析聚焦?jié)舛炔?、篩分分配平衡電荷、濃度差生物親和作用疏水作用電荷、濃度差脫鹽、分子分級(jí)甾醇、維生素、肽蛋白質(zhì)、氨基酸、抗生素、核酸、有機(jī)酸蛋白質(zhì)、核酸蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)電泳凝膠電泳等電點(diǎn)電泳等速電泳區(qū)帶電泳篩分、電荷篩分、電荷、濃度差篩分、電荷、濃度差篩分、電荷、濃度差蛋白質(zhì)、核酸蛋白質(zhì)、氨基酸蛋白質(zhì)、氨基酸蛋白質(zhì)、核酸離心離心過(guò)濾離心沉降超離心離心力、篩分離心力離心力菌體、菌體碎片菌體、細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類四、發(fā)酵工業(yè)下游技術(shù)的一般工藝過(guò)程1.一般工藝過(guò)程下游加工過(guò)程可分為4個(gè)階段：培養(yǎng)液(發(fā)酵液)的預(yù)處理和固液分離初步純化(提取)高度純化(精制)成品加工2.工藝過(guò)程的劃分（1）預(yù)處理和固液分離：目的是除去發(fā)酵液中的菌體細(xì)胞和不溶性固體雜質(zhì)。（2）初步分離：目的是除去與產(chǎn)物性質(zhì)差異較大的雜質(zhì)。（3）高度純化：去除與產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)比較接近的雜質(zhì)。（4）成品制作：成品形式由產(chǎn)品的最終用途決定。3.選擇下游加工工藝的原則（1）是胞內(nèi)產(chǎn)物還是胞外產(chǎn)物（2）原料中產(chǎn)物和主要雜質(zhì)濃度（3）產(chǎn)物和主要雜質(zhì)的物理化學(xué)特性及差異（4）產(chǎn)品用途和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（5）產(chǎn)品的市場(chǎng)價(jià)格（6）廢液的處理方法等第二節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離發(fā)酵液預(yù)處理和固液分離的目的:(1)分離菌體和其他懸浮顆粒(細(xì)胞碎片、核酸和蛋白質(zhì)的沉淀物)；(2)除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液性質(zhì)，以利于提取和精制的順利進(jìn)行。一、發(fā)酵液的預(yù)處理（一）預(yù)處理的方法①高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除方法②雜蛋白質(zhì)的去除③發(fā)酵液的凝聚和絮凝1.高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除方法（1）鈣離子草酸草酸溶解度較小，故用量大時(shí)，可用其可溶性鹽，如草酸鈉。反應(yīng)生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固，提高濾液(也稱為原液)質(zhì)量。但草酸價(jià)格較貴，應(yīng)注意回收。如四環(huán)類抗生素廢液中，加入硫酸鉛，在60℃下反應(yīng)生成草酸鉛。后者在90~95℃下用硫酸分解，經(jīng)過(guò)濾、冷卻、結(jié)晶后可以回收草酸。

（2）鎂離子三聚磷酸鈉它和鎂離子形成可溶性絡(luò)合物，用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。此法可用于環(huán)絲氨酸的提取。

（3）鐵離子黃血鹽使形成普魯士藍(lán)沉淀

2.雜蛋白質(zhì)的去除方法（1）熱變性（2）沉淀（3）大幅度改變pH3.發(fā)酵液的凝聚和絮凝凝聚是在中性鹽作用下，由于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過(guò)程，是一種以物理的集合為主的過(guò)程。（1）機(jī)理電解質(zhì)將膠體粒子表面上的電荷中和，減少存在于膠體粒子間的靜電斥力，使倫敦·范德華(London—Vanderwaals)吸引力占優(yōu)勢(shì)，這樣膠體就會(huì)凝聚成較大、較密實(shí)的粒子，或在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)使之更容易過(guò)濾。（2）方法在稀溶液中加入電解質(zhì)試劑：酸、堿、簡(jiǎn)單電解質(zhì)、合成的高分子電解質(zhì)（3）常用的絮凝劑聚丙烯酰胺、聚乙烯亞胺、聚胺衍生物、氯化鈣、磷酸氫二鈉（4）影響絮凝的因素絮凝劑的加量、絮凝劑的分子量和類型、溶液的pH、攪拌速度和時(shí)間等A.絮凝劑的加量（淀粉酶發(fā)酵液的絮凝試驗(yàn)）B.溶液的pH

（采用堿式氯化鋁和陰離子聚丙烯酰胺搭配使用的混凝方法處理2709堿性蛋白酶發(fā)酵液）絮凝技術(shù)預(yù)處理發(fā)酵液的優(yōu)點(diǎn)：①提高過(guò)濾速度的②有效地去除雜蛋白質(zhì)和固體雜質(zhì)，提高了濾液質(zhì)量二、發(fā)酵液的過(guò)濾過(guò)濾就是將懸浮在發(fā)酵液中的固體顆粒與液體進(jìn)行分離的過(guò)程。1.影響過(guò)濾速度的因素①菌種②發(fā)酵條件（培養(yǎng)基的組成、未用完培養(yǎng)基的數(shù)量、消沫油、發(fā)酵周期）（1）菌種對(duì)過(guò)濾速度影響真菌的菌絲比較粗大，不需特殊處理。其濾渣呈緊密餅狀物，很容易從濾布上刮下來(lái)，故可采用鼓式真空過(guò)濾機(jī)過(guò)濾。

放線菌發(fā)酵液菌絲細(xì)而分枝，交織成網(wǎng)絡(luò)狀，還含有很多多糖類物質(zhì)，粘性強(qiáng)，過(guò)濾較困難，一般需經(jīng)預(yù)處理，以凝固蛋白質(zhì)等膠體。

細(xì)菌發(fā)酵液的菌體更細(xì)小，要采用絮凝等方法預(yù)處理發(fā)酵液。難以采用常規(guī)過(guò)濾的設(shè)備來(lái)完成過(guò)濾操作。

（2）培養(yǎng)基的組成對(duì)過(guò)濾速度影響用黃豆粉、花生粉作氮源，淀粉作碳源（過(guò)濾困難）發(fā)酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培養(yǎng)基（3）發(fā)酵周期對(duì)過(guò)濾的影響

正確選擇發(fā)酵終了時(shí)間對(duì)過(guò)濾影響很大。在菌絲體自溶前必須放罐，因?yàn)榧?xì)胞自治后的分解產(chǎn)物一般很難過(guò)濾。有時(shí)延長(zhǎng)發(fā)酵周期雖能使發(fā)酵單位有所提高，但嚴(yán)重影響發(fā)酵液質(zhì)量，使色素和膠狀雜質(zhì)增多、過(guò)濾困難，最終造成成品質(zhì)量降低。2.改善過(guò)濾性能的方法用于改善發(fā)酵液過(guò)濾性能的方法通常有：等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)變性、吸附、凝聚和絮凝、加入助濾劑、直接在發(fā)酵液中形成填充-凝固劑、酶解作用（1）過(guò)濾助劑助濾劑不可壓縮的多孔微粒、能使濾餅疏松、濾速增大過(guò)濾助劑可解決兩個(gè)問(wèn)題：①濾餅的可壓縮性問(wèn)題②滲透性問(wèn)題:小粒子如菌絲碎片和細(xì)菌細(xì)胞，會(huì)滲入到轉(zhuǎn)鼓真空過(guò)濾預(yù)覆蓋層內(nèi)部。使得預(yù)覆蓋層的部分孔被堵塞，影響了滲透性。常用的過(guò)濾助劑有：硅藻土、珍珠巖、磨碎的木漿、淀粉助濾劑的加入方法：①在濾布上預(yù)先鋪一層助濾劑(1~2mm)濾速降低，濾液透明度高②直接加入發(fā)酵液中助濾劑的用量即助濾劑用量若等于懸浮液中固體含量時(shí)，濾速最快。（2）填充-凝固劑加入一些反應(yīng)劑，它們能相互作用，或和某些溶解性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶解的沉淀(CaSO4，AlPO4等)。生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身即可作為助濾劑，并且還能使膠狀物和懸浮物凝固。正確選擇反應(yīng)劑和反應(yīng)條件，能使過(guò)濾速度提高3~10倍。（3）酶解作用

如發(fā)酵液中有不溶解的多糖存在則最好用酶將它轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過(guò)濾速度。例如萬(wàn)古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，加入淀粉酶后，能使過(guò)濾速度加快。3.固-液分離設(shè)備的選擇常用于發(fā)酵液的分離設(shè)備：板框壓濾機(jī)、鼓式真空過(guò)濾機(jī)、離心沉降分離機(jī)（1）板框壓濾機(jī)優(yōu)點(diǎn)：①板框壓濾機(jī)的過(guò)濾面積大②過(guò)濾推動(dòng)力(壓力差)能較大幅度地進(jìn)行調(diào)整，并能耐受較高的壓力差③結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，價(jià)格低④動(dòng)力消耗少缺點(diǎn)：①不能連續(xù)操作，設(shè)備笨重，勞動(dòng)強(qiáng)度大②衛(wèi)生條件差③非生產(chǎn)的輔助時(shí)間長(zhǎng)，阻礙了過(guò)濾效率的提高（2）鼓式真空過(guò)濾機(jī)優(yōu)點(diǎn)：①能連續(xù)操作②能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制缺點(diǎn)：壓差較小，主要適用于霉菌發(fā)酵液的過(guò)濾。（3）離心分離優(yōu)點(diǎn)：①分離速度快，效率高②操作時(shí)衛(wèi)生條件好等優(yōu)點(diǎn)③適合于大規(guī)模的分離過(guò)程缺點(diǎn)：①投資費(fèi)用高②能耗較大三、微生物細(xì)胞的破碎微生物的代謝產(chǎn)物分泌到細(xì)胞或組織之外的，稱為胞外產(chǎn)物。細(xì)菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶，霉菌產(chǎn)生的糖化酶等

微生物的代謝產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)的，稱為胞內(nèi)產(chǎn)物。例如青霉素?；福瑝A性磷酸酯酶等

對(duì)于胞外產(chǎn)物只需直接將發(fā)酵液預(yù)處理及過(guò)濾，獲得澄清的濾液，作為進(jìn)一步純化的出發(fā)原液;對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，則需首先收集菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎，使代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相中，然后，再進(jìn)行細(xì)胞碎片的分離。1.微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)常見(jiàn)的細(xì)胞破碎方法：機(jī)械方法球磨機(jī)、高壓勻漿器、X-press法、超聲波破碎非機(jī)械方法酶解法、滲透壓沖擊、凍結(jié)和融化、干燥法、化學(xué)法（1）球磨機(jī)研磨是將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使達(dá)到細(xì)胞的某種程度破碎。缺點(diǎn)是在破碎期間樣品溫度迅速升高，通過(guò)用二氧化碳來(lái)冷卻容器可得到部分解決。

（2）高壓勻漿器利用高壓迫使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊造成細(xì)胞破裂。各種菌體一次通過(guò)高壓勻漿器的破碎率菌體壓力（Mpa）破碎率（%）面包酵母啤酒酵母大腸桿菌解肢假絲酵母5355535562616743（3）X-press法一種改進(jìn)的高壓方法將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25?C至-30?C形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，包埋在冰中的微生物的變形所引起的。優(yōu)點(diǎn)：適用的范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片的粉碎程度低、活性的保留率高對(duì)冷凍—融解敏感的生化物質(zhì)不適用（4）超聲波法細(xì)胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，從而產(chǎn)生一個(gè)極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，從而使細(xì)胞破碎。對(duì)于不同菌種的發(fā)酵液，超聲波處理的效果不同。不宜大規(guī)模操作（5）酶解法利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵，從而達(dá)到破壁的目的。優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)，發(fā)生酶解的條件溫和。缺點(diǎn)：酶水解費(fèi)用較貴，一般只適用于小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室研究。溶菌酶能專一地分解細(xì)胞壁上糖蛋白分子的α-1，4糖苷鍵，使脂多糖解離，經(jīng)溶菌酶處理后的細(xì)胞移至低滲溶液中使細(xì)胞破裂。（6）自溶作用是酶解的另一種方法，所需溶胞的酶是由微生物本身產(chǎn)生的。影響自溶過(guò)程的因素有溫度、時(shí)間、pH緩沖液濃度、細(xì)胞代謝途徑等。自溶法在一定程度上能用于工業(yè)規(guī)模，但是，對(duì)不穩(wěn)定的微生物容易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后的細(xì)胞培養(yǎng)液過(guò)濾速度也會(huì)降低。

（7）滲透壓沖擊將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液)，達(dá)到平衡后，介質(zhì)被突然稀釋，或者將細(xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞壁的破裂。對(duì)細(xì)胞壁較脆弱的菌，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理，或合成受抑制而強(qiáng)度減弱時(shí)才合適。（8）凍結(jié)-融化法將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍和室溫下融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細(xì)胞膜的硫水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加了細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞突然膨脹而破裂。細(xì)胞壁較脆弱的菌體適用（9）干燥法采用空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等空氣干燥主要適用于酵母菌真空干燥適用于細(xì)菌的干燥冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)干燥法條件變化較劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其它組織變性。（10）化學(xué)法用酸堿及表面活性劑處理，可以使蛋白質(zhì)水解，細(xì)胞溶解或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來(lái)。某些脂溶性溶劑也能作為化學(xué)處理的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。這些試劑容易引起生化物質(zhì)破壞，還會(huì)帶來(lái)分離和回收化學(xué)物質(zhì)的問(wèn)題。細(xì)胞破碎方法分類分類作用機(jī)理適應(yīng)性機(jī)械法球磨法固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難高壓勻漿法液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽(yáng)性菌超聲破碎法液體剪切作用對(duì)酵母菌效果較差，破碎過(guò)程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物不適應(yīng)非機(jī)械法酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價(jià)格高，通用性差化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差滲透壓法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感的目的產(chǎn)物干燥法改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活2.破碎方法的選擇選擇合適的破碎方法需要考慮下列因素：（1）細(xì)胞的數(shù)量（2）所需要的產(chǎn)物對(duì)破碎條件（溫度、化學(xué)試劑、酶等）的敏感性（3）要達(dá)到的破碎程度及破碎所必要的速度（4）盡可能采用最溫和的方法（5）具有大規(guī)模應(yīng)用潛力的生化產(chǎn)品應(yīng)選擇適合于放大的破碎技術(shù)第三節(jié)沉淀法根據(jù)所加入沉淀劑，可以分為：鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、非離子型聚合物沉淀法、聚電解質(zhì)沉淀法、高價(jià)金屬離子沉淀法一、鹽析法1.鹽析的定義在蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽使其沉淀析出的過(guò)程。2.機(jī)理通過(guò)破壞蛋白質(zhì)分子表面水膜或中和蛋白質(zhì)分子表面水膜使蛋白質(zhì)凝聚沉淀。3.優(yōu)點(diǎn)成本低操作簡(jiǎn)單，安全對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。4.缺點(diǎn)沉淀物中含有大量的鹽析劑5.鹽析用中性鹽的選擇（1）常用的中性鹽MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4、NaH2PO4（2）選擇中性鹽應(yīng)注意的問(wèn)題使酶沉淀完全，收率高有利于酶的提純，本身又易去除對(duì)酶無(wú)毒性，應(yīng)用不受影響價(jià)格低廉廢水處理容易6.鹽析劑用量的確定采用實(shí)驗(yàn)的方法確定7.鹽濃度的表示法鹽析法中的鹽濃度通常以鹽溶液的飽和度表示，飽和的溶液成為100%飽和度。8.蛋白質(zhì)的濃度與鹽析的關(guān)系溶液中蛋白質(zhì)濃度與中型鹽用量成正比，但是如果蛋白質(zhì)本身在溶液中含量很低，則需加入較多的中性鹽。9.離子強(qiáng)度和類型對(duì)鹽析的影響

幾種蛋白質(zhì)析出時(shí)所需硫酸銨的離子的強(qiáng)度蛋白質(zhì)在不同電解質(zhì)中的鹽析效應(yīng)幾種不同電解質(zhì)下，一氧化碳血紅蛋白溶解度曲線。圖中不同離子種類對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響，可以從Hofmeister系列理論中獲得解釋：即離子半徑小而很高電荷的離子在鹽析方面影響較強(qiáng)，離子半徑大而低電荷的離子的影響較弱。單價(jià)鹽如KCl，NaCl的鹽析效果一般比較差。10.pH對(duì)鹽析的影響

一般地說(shuō)，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度越大；如果所帶的電荷減少至接近于零時(shí)溶解度最少，我們稱此時(shí)的pH值為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(PI)。改變pH或特異地加入與蛋白質(zhì)極性基團(tuán)結(jié)合的離子(叫反離子)即可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，也就是改變了蛋白質(zhì)的溶解度。

注意：在水中或稀鹽溶液中測(cè)得的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與高鹽濃度下所測(cè)的結(jié)果是不同的。需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整pH值至蛋白質(zhì)溶解度最低處，才能使鹽析獲得更好效果。11.溫度對(duì)鹽析的影響溫度是影響溶解度的重要因素，對(duì)于許多無(wú)機(jī)鹽和小分子的有機(jī)化合物，溫度升高，溶解度也相應(yīng)增大；但對(duì)于蛋白質(zhì)、酶等生物大分子在高離子強(qiáng)度溶液中，溫度的升高，它們的溶解度有時(shí)不但不升高。反而減少。許多蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度溶液中25C時(shí)的溶解度比4C時(shí)溶解度明顯地減少。

但必須指出這種溫度升高溶解度的下降現(xiàn)象只有在高離子強(qiáng)度下才能發(fā)生。在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度大多數(shù)在一定范圍內(nèi)是隨著溫度增加而增加的。

在一般情況下，蛋白質(zhì)的鹽析溫度要求不嚴(yán)格，可以在室溫下進(jìn)行，只有某些對(duì)溫度比較敏感的酶，要求在低溫0-4C下操作。以避免活力的喪失。二、有機(jī)溶劑沉淀1.原理有機(jī)溶劑的沉淀作用主要是降低水溶液的介電常數(shù)，溶液的介電常數(shù)減少就意味著溶質(zhì)分子異性電荷庫(kù)侖引力的增加從而使溶解度減少。2.優(yōu)點(diǎn)（1）分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只有在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。（2）沉淀不用脫鹽，過(guò)濾比較容易。（3）在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛3.缺點(diǎn)容易引起蛋白質(zhì)變性失活，操作常需在低溫下進(jìn)行。且有機(jī)溶劑易燃、易爆、安全要求較高。4.常用的有機(jī)溶劑常用的有機(jī)溶劑有：乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇。5.有機(jī)溶劑的選擇有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)的能力隨蛋白質(zhì)種類及有機(jī)溶劑的種類而異。對(duì)曲霉淀粉酶而言，有機(jī)溶劑沉淀能力，依次為丙酮＞異丙醇＞乙醇＞甲醇。這個(gè)順序還受溫度、pH、鹽離子濃度的影響。丙酮沉淀能力最強(qiáng)，但揮發(fā)損失多，價(jià)格相對(duì)較高，工業(yè)上一般采用乙醇。

6.有機(jī)溶劑沉淀的影響因素影響有機(jī)溶劑沉淀的因素有：溫度、蛋白的濃度、pH、金屬離子、離子強(qiáng)度。（1）溫度對(duì)有機(jī)溶劑沉淀的影響蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度反應(yīng)特別敏感，溫度稍高即發(fā)生變性。因此，加入的有機(jī)溶劑都必須預(yù)冷至較低溫度，操作要在冰浴中進(jìn)行，同時(shí)加入有機(jī)溶劑必須緩慢而又不斷攪拌以免溶劑局部過(guò)濃。溫度的高低會(huì)影響到已沉淀的蛋白質(zhì)復(fù)溶。（2）蛋白質(zhì)濃度對(duì)有機(jī)溶劑沉淀的影響低濃度樣品使用有機(jī)溶劑的量大但共沉作用小，利于提高分離的效果；高濃度樣品可以節(jié)省有機(jī)溶劑，減少變性危險(xiǎn)，但共沉作用大，分離效果較差。（3）pH值對(duì)有機(jī)溶劑沉淀的影響在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定范圍下選擇溶解度最低處的pH值，有利于提高沉淀效果。適宜的pH值可大大提高分離的分辨能力（4）金屬離子對(duì)有機(jī)溶劑沉淀的影響

一些多價(jià)離子如Zn2+和Ca2+在一定的pH值下能與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物在水中或有機(jī)溶劑中的溶解度都大大降低，而不影響蛋白質(zhì)的活性。（5）離子強(qiáng)度對(duì)有機(jī)溶劑沉淀的影響離子強(qiáng)度是影響溶質(zhì)在有機(jī)溶劑及水混合液中溶解度的一個(gè)重要因素，鹽的濃度大小或太大都對(duì)分離有不利影響，對(duì)于蛋白質(zhì)，在有機(jī)溶劑中鹽的濃度不超過(guò)5%比較合適，使用的乙醇量也以不超過(guò)二倍體積為宜。7.有機(jī)溶劑沉淀應(yīng)注意的問(wèn)題（1）降低溫度，能增加收率和減少蛋白質(zhì)的變性。（2）所選擇的溶劑必須能和水互溶，而和蛋白質(zhì)不起作用。（3）蛋白質(zhì)的分子量越大，產(chǎn)生沉淀所需加入的有機(jī)溶劑量越少。（4）一種蛋白質(zhì)的溶解度通常會(huì)由于另一蛋白質(zhì)的存在而降低。（5）沉淀的蛋白質(zhì)如不能再溶解，就可能已經(jīng)變性。（6）對(duì)很多酶，丙酮加量在20%~50%之間，就能產(chǎn)生沉淀。（7）接近等電點(diǎn)時(shí)，以引起沉淀所需加入有機(jī)溶劑的量較少。（8）當(dāng)溶劑量達(dá)到50%時(shí)，則通常只有分子量小于15000的蛋白質(zhì)仍留在溶液中。（9）少量中性鹽的存在能產(chǎn)生鹽溶作用，增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑水溶液的溶解度。三、等電點(diǎn)沉淀法1.原理

等電點(diǎn)沉淀法主要利用兩性分子上的電中性時(shí)溶解度最低，而各種兩性分子具有不同等電點(diǎn)而進(jìn)行分離的一種方法。兩性分子在處于等電點(diǎn)時(shí)的pH值，再加上其他沉淀因素，則很易沉淀析出。2.等電點(diǎn)沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在偏酸性范圍內(nèi)，而無(wú)機(jī)酸通常價(jià)較廉，井且某些酸，如磷酸、鹽酸和硫酸的應(yīng)用能為蛋白質(zhì)類食品所允許。同時(shí)，?？芍苯舆M(jìn)行其他純化操作，無(wú)需將殘余的酸除去。缺點(diǎn)：酸化時(shí)，易使蛋白質(zhì)失活，這是由于蛋白質(zhì)對(duì)低pH比較敏感。第四節(jié)吸附法在發(fā)酵工業(yè)的下游加工過(guò)程中，吸附法應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)品的除雜、脫色、有毒物質(zhì)和抗生素的提純精制。應(yīng)用選擇性吸附法分離精制的產(chǎn)品包括：蛋白質(zhì)、核酸、酶、抗生素、氨基酸。

一、吸附法的原理吸附法是利用吸附劑與雜質(zhì)、色素物質(zhì)、有毒物質(zhì)、產(chǎn)品之間分子引力的差異，從而起到分離的作用。二、吸附的目的將產(chǎn)品吸附濃縮于吸附劑上；將雜質(zhì)、色素等需要從發(fā)酵液中去除的物質(zhì)吸附于吸附劑上。三、吸附法的優(yōu)缺點(diǎn)1.優(yōu)點(diǎn)可不用或少用有機(jī)溶劑；操作簡(jiǎn)便、安全、設(shè)備簡(jiǎn)單；生產(chǎn)過(guò)程中pH變化小，適用于穩(wěn)定性較差的生化物質(zhì)。2.缺點(diǎn)吸附法選擇性差、收率不高。無(wú)機(jī)吸附劑性能不穩(wěn)定，不能連續(xù)操作，勞動(dòng)強(qiáng)度大。炭粉等吸附劑影響環(huán)境衛(wèi)生。由于凝膠類吸附劑、大網(wǎng)格聚合物吸附劑的應(yīng)用，克服了以上缺點(diǎn)，近年吸附法又得到重視。四、吸附的類型

1.物理吸附吸附劑和吸附物通過(guò)分子力(范德華力)產(chǎn)生的吸附。2.化學(xué)吸附化學(xué)吸附是由于吸附劑在吸附物之間的電子轉(zhuǎn)移，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的，屬于庫(kù)侖力范圍。3.交換吸附吸附劑表面如為極性分子或離子所組成則它會(huì)吸引溶液中帶相反電荷的離子而形成雙電層。這種吸附又稱為極性吸附。五、吸附劑的基本要求1.吸附劑要求顆粒密度小，表面積大，但孔隙也不能太多，否則被吸附物質(zhì)不易被洗脫。2.吸附劑的顆粒大小要均勻。3.吸附劑的吸附能力要大，但不能影響洗脫。六、吸附劑的種類1.疏水或非極性吸附劑（活性炭）2.親水或極性吸附劑（硅膠、氧化鋁）3.離子交換樹(shù)脂吸附劑七、影響吸附過(guò)程的因素1.吸附劑的性質(zhì)吸附劑的理化性質(zhì)對(duì)吸附的影響很大。吸附劑的性質(zhì)與其原料、合成方法和再生條件有關(guān)。一般要求吸附容量大，吸附速度快和機(jī)械強(qiáng)度好。吸附劑的吸附容量除其它外界條件外，主要與比表面積有關(guān)。比表面大，空隙度高，吸附容量就越大。吸附速度主要與顆粒度和孔徑分布有關(guān)，顆粒度越小，吸附速度就越快，但壓頭損失要增大。孔徑適當(dāng)，有利于吸附物向空隙中擴(kuò)散。吸附劑的機(jī)械強(qiáng)度則影響其使用壽命。2.吸附物的性質(zhì)有下列一些規(guī)則可用來(lái)預(yù)測(cè)吸附的相對(duì)量。（1）能使表面張力降低的物質(zhì)，易為表面吸附；（2）溶質(zhì)從較易溶解的溶劑中吸附時(shí)，吸附量較少。（3）極性吸附劑易吸附極性物質(zhì)，非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)。（4）對(duì)于同系列物質(zhì)，吸附量的變化是有規(guī)則的。如按極性減小的次序排列，次序越在后面的物質(zhì)，極性越差，因而越易為非極性吸附劑所吸附而越難為極性吸附劑所吸附。3.溶液pH值的影響pH值影響某些化合物的離解度。4.溫度的影響吸附熱越大，則溫度對(duì)吸附的影響越大。5.其它組分的影響

當(dāng)從含有兩種以上組分的溶液中吸附時(shí)，根據(jù)溶質(zhì)的性質(zhì)可以互相促進(jìn)，干擾或互不干擾。一般說(shuō)來(lái)，對(duì)混合物的吸附較純物質(zhì)的吸附為差。

第五節(jié)離子交換法

離子交換作用：是指一個(gè)溶液中的某一種離子與一個(gè)固體中的另一種具有相同電荷的離子互相調(diào)換位置，即溶液中的離子跑到固體上去，把固體上的離子替換下來(lái)。這里溶液稱流動(dòng)相，而固體稱固定相。在發(fā)酵工業(yè)中可用于分離純化蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、酶、抗生素等物質(zhì)。一、基本原理

離子交換劑通常是一種不溶性高分子化合物，它的分子中含有可解離的基團(tuán)，這些基因在水溶液中能與溶液中的其它陽(yáng)離子或陰離子起交換作用。離子交換過(guò)程有兩個(gè)階段──吸附和解吸附。二、離子交換劑的分類

1.陽(yáng)離子交換劑：磺酸(-SO3H)、磷酸(-PO3H2)、羧酸（-COOH）和酚羥基（-OH）。可分為：強(qiáng)酸型、中酸型和弱酸型。2.陰離子交換劑：伯胺、(-NH2)、仲胺(-NHCH3)、叔胺[N-（CH3）2]和季胺[-N（CH3）2]。可分為：強(qiáng)堿性、中堿性和弱堿性3.兩性離子交換劑4.選擇性離子交換劑5.吸附樹(shù)脂6.電子交換樹(shù)脂三、影響離子交換速度的因素1.樹(shù)脂顆粒的大小；2.樹(shù)脂的交聯(lián)度；3.溶液中離子濃度；4.溫度；5.離子的大小；6.離子價(jià)；7.樹(shù)脂強(qiáng)弱。四、離子交換的操作方式1.分批法2.固定床法3.流動(dòng)床法第六節(jié)膜分離過(guò)程膜分離技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1.適用范圍廣；2.膜分離過(guò)程為物理過(guò)程，不需加入化學(xué)藥劑；3.膜分離技術(shù)分離裝置簡(jiǎn)單，占地面積小，系統(tǒng)集成容易；4.膜分離過(guò)程系統(tǒng)簡(jiǎn)單、操作容易，且易控制，便于維修，有利于生產(chǎn)自動(dòng)化的推廣與普及。一、膜分離方法的分類

1.分類根據(jù)膜材質(zhì)和方法的差異，可將膜分離方法分為以下種類：（1）透析；（2）超濾；（3）反滲透；（4）微濾；（5）電滲析；（6）液膜技術(shù)（7）氣體滲透；（8）滲透蒸發(fā)2.膜過(guò)濾的孔徑范圍

二、表征膜性能的參數(shù)

1.孔的性質(zhì)(包括孔徑、孔分布和孔隙度)；2.水通量；3.截留率的截?cái)喾肿恿浚?.抗壓能力；5.pH適用范圍；6.對(duì)熱和溶劑的穩(wěn)定性。三、膜分離設(shè)備1.選擇膜分離設(shè)備應(yīng)考慮以下因素：（1）分離類型；（2）生產(chǎn)量；（3）操作時(shí)的應(yīng)變性；（4）保養(yǎng)難易程度；（5）操作方便與否。2.常用的膜分離設(shè)備（1）管式過(guò)濾器（內(nèi)壓式和外壓式）

（2）中空式過(guò)濾器中空纖維膜組件用粗的中空纖維膜組裝成用于超過(guò)濾的膜組件，它具有類似于單管程管殼式換熱器的結(jié)構(gòu)。所用的中空纖維，在內(nèi)壁或內(nèi)、外壁形成表層。內(nèi)壓式膜組件適合于管內(nèi)流過(guò)料液，管間匯集滲濾波，外壓式膜組件相反，管間走料液，管內(nèi)匯集滲濾液。（3）螺旋卷式過(guò)濾器卷式膜組件是用平面膜卷制而成的。（4）平板式過(guò)濾器板式膜組件用平面膜組成。

各種膜分離設(shè)備性能的比較形式優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)管式易清洗，無(wú)死角適宜于處理固體較多的料液，單根管子可以調(diào)換保留體積大，單位體積中所含過(guò)濾面積較小，壓力降大中空纖維保留體積小，單位體積中所含過(guò)濾面積大，可以逆洗，操作壓力較低（0.25Mpa），動(dòng)力消耗較低料液需要預(yù)處理，單根纖維損壞時(shí)，需調(diào)換整個(gè)模件螺旋卷式膜單位體積中所含過(guò)濾面積大，換新膜容易料液需要預(yù)處理，壓力降大，易污染，清洗困難平板式保留體積小，能量消耗界于管式和螺旋卷式之間死體積較大四、操作特性1.濃差極化：當(dāng)溶劑透過(guò)膜，而溶質(zhì)留在膜上，因而便膜面濃度增大，并高于主體中濃度這種濃度差導(dǎo)致溶質(zhì)自膜面反擴(kuò)散至主體中，這種現(xiàn)象稱為濃差極化。2.凝膠層：當(dāng)膜面濃度增大時(shí)，通量降低。當(dāng)膜面濃度增大到某一值時(shí)，溶質(zhì)成最緊密排列，或析出形成凝膠層。濃差極化示意圖凝膠層的形成膜過(guò)濾一般采用的錯(cuò)流過(guò)濾方式。錯(cuò)流過(guò)濾是一種新的過(guò)濾方式與常規(guī)過(guò)濾的區(qū)別在于它的固體懸浮液流動(dòng)方向與過(guò)濾介質(zhì)平行，而常規(guī)過(guò)濾則是垂直的，因此，能連續(xù)清除過(guò)濾介質(zhì)表面的滯留物，使濾餅不能形成，所以整個(gè)過(guò)濾中能保持較高的濾速。五、膜分離過(guò)程在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用

微濾（MF）膜、超濾（UF）膜、納濾（NF）膜、反滲透（RO）膜六、影響超濾速度的各種因素

1.壓力當(dāng)壓力較低時(shí)，通量較小，膜面上尚未形成濃差極化層，此時(shí)通量隨壓差成正比增大;當(dāng)壓力逐漸增大時(shí)，膜面上開(kāi)始形成濃差極化層，通量隨壓差而增大的速度開(kāi)始減慢。注:當(dāng)壓力繼續(xù)增大時(shí)，濃差極化層濃度達(dá)到凝膠層濃度時(shí)，通量不隨壓差而改變。因?yàn)楫?dāng)壓力繼續(xù)增大時(shí)，雖暫時(shí)可使通量增加，但凝膠層厚度也隨之增大，即阻力增大，而使通量回復(fù)至原值。

2.發(fā)酵液濃度、溫度、流速通量與料液流速成正比；通量與操作溫度成正比；通量與固體濃度成反比。

3.膜的污染膜在使用中，盡管操作條件保持不變，但通量仍逐漸降低的現(xiàn)象稱為污染。污染的原因一般認(rèn)為是膜與料液中某一溶質(zhì)的相互作用，或吸附在膜上的溶質(zhì)和其它溶質(zhì)的相互作用而引起的。膜污染與濃差極化的區(qū)別：濃差極化是可逆的，即變更操作條件可以使?jié)獠顦O化消除，而污染則必須通過(guò)清洗的辦法，才能消除。經(jīng)清洗后如純水通晝達(dá)到或接近原來(lái)水平，則認(rèn)為污染已消除。減輕膜污染的方法①預(yù)處理將料液經(jīng)過(guò)一預(yù)過(guò)濾，以除去較大的粒子，特別對(duì)中空纖維和螺旋卷繞式超濾器尤為重要。蛋白質(zhì)吸附在膜表面上常是形成污染的原因，調(diào)節(jié)料液的pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)可使吸附作用減弱。②改變膜的表面性質(zhì)制膜時(shí)，改變膜的表面極性和電荷，常可減輕污染。膜的清洗方法①機(jī)械方法：加海綿球，增大流速，逆洗(對(duì)中空纖維超濾器)，脈沖流動(dòng)，超聲波等。②化學(xué)方法用起溶解作用的物質(zhì)，如：酸、堿、酶(蛋白酶)，螯合劑，表面活性劑。用起切斷離子結(jié)合作用的方法，如改變離子強(qiáng)度、pH、電位。起氧化作用的物質(zhì)，如過(guò)氧化氫、次氯酸鹽。用起滲透作用的物質(zhì)，如磷酸鹽、聚磷酸鹽第七節(jié)萃取是用一種溶劑將產(chǎn)物自另一種溶劑(如水)中提取出來(lái)，達(dá)到濃縮和提純的目的。溶劑萃取法比化學(xué)沉淀法分離程度高，比離子交換法選擇性好，傳質(zhì)快，比蒸餾法能耗低且生產(chǎn)能力大，周期短，便于連續(xù)操作、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等。近二十年來(lái)又涌現(xiàn)出許多新型的萃取技術(shù)，如：雙（兩）水相萃??；反相膠束（膠團(tuán)）萃??；超臨界萃取；液膜萃取等。一、萃取的原理利用物質(zhì)在兩種成相的溶劑中溶解度的不同，使所需的目的物質(zhì)從一種溶劑中轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中，從而達(dá)到分離純化的目的。溶劑萃取法是以分配定律為基礎(chǔ)的。在萃取中，被提取的溶液稱為料液，其中欲提取的物質(zhì)稱為溶質(zhì)。分配定律：在恒溫恒壓的條件下，一種物質(zhì)在兩種成相的溶劑（A與B，或上相與下相）的分配濃度之比是一常數(shù)，該常數(shù)稱為分配系數(shù)K。

二、雙（兩）水相萃取雙水相系統(tǒng)是指某些高聚物之間或高聚物與無(wú)機(jī)鹽之間在水中以適當(dāng)?shù)臐舛热芙鈺?huì)形成互不相溶的兩水相或多水相系統(tǒng)。通過(guò)溶質(zhì)在相間的分配系數(shù)的差異而進(jìn)行萃取的方法即為雙水相萃取。雙水相技術(shù)最早出現(xiàn)于1955年。

實(shí)例：氨基酸、多肽、核酸、病毒等,特別是成功地應(yīng)用在蛋白質(zhì)的大規(guī)模分離中。典型的兩水相系統(tǒng)A聚丙二醇-聚乙二醇-聚乙烯醇-葡聚糖聚乙二醇-聚乙烯醇-葡聚糖-聚乙烯吡咯烷酮BDEAE葡聚糖HCl-聚丙二醇NaCl-聚乙二醇Li2SO4C羧甲基葡聚糖鈉鹽-羧甲基纖維素鈉鹽D聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇-磷酸鉀-硫酸銨-硫酸鈉A類為兩種非離子型聚合物；B類其中一種為帶電荷的聚電解質(zhì)；C類兩種都為聚電解質(zhì)；D類為一種聚合物與一種無(wú)機(jī)鹽組成。1.雙水相萃取的優(yōu)點(diǎn)（1）易于放大；（2）雙水相系統(tǒng)之間的傳質(zhì)過(guò)程和平衡過(guò)程快速,因此能耗較小,可以實(shí)現(xiàn)快速分離；（3）易于進(jìn)行連續(xù)化操作；（4）相分離過(guò)程溫和,生化分子如酶不易受到破壞；（5）選擇性高、收率高；（6）操作條件溫和。2.相圖兩水相形成的條件和定量關(guān)系可用相圖來(lái)表示，對(duì)于由兩種聚合物和水組成的系統(tǒng)，其相圖如上圖所示。圖中以聚合物Q的濃度(重量％)為縱坐標(biāo)，以聚合物P的濃度(重量%)為橫坐標(biāo)。只有當(dāng)P、Q達(dá)到一定濃度時(shí)才會(huì)形成兩相。圖中曲線把均勻區(qū)域和兩相區(qū)域分隔開(kāi)來(lái)，稱為雙節(jié)線。在雙節(jié)線下面的區(qū)域是均勻的，在上面的區(qū)域?yàn)閮上鄥^(qū)。例如點(diǎn)M代表整個(gè)系統(tǒng)的組成，該系統(tǒng)實(shí)際上由兩相組成，上相和下相分別由點(diǎn)T和B表示。M、T、B三點(diǎn)在一直線上，T和B代表成平衡的兩相，其相連的直線稱為系線。在同一條系線上的各點(diǎn)分成的兩相，具有相同的組成，但體積比不同。令VT、VB分別代表上相和下相的體積，則有令WT，WB，WM分別代表上相、下相和系統(tǒng)的總重量當(dāng)系線向下移動(dòng)時(shí)，長(zhǎng)度逐漸減小，這說(shuō)明兩相的差別減小，當(dāng)達(dá)到K點(diǎn)時(shí)，系線的長(zhǎng)度為零，兩相間差別消失，點(diǎn)K稱為臨界點(diǎn)。雙節(jié)線的位置與形狀與聚合物的分子量有關(guān)。聚合物的分子量越高，相分離所需的濃度越低；兩種聚合物的分子量相差越大，雙節(jié)線的形狀越不對(duì)稱。3.雙水相萃取的影響因素生物物質(zhì)在雙水相中的分配系數(shù)主要由化學(xué)電位、疏水作用、生物親和力、粒子大小和蛋白質(zhì)的構(gòu)象效應(yīng)所決定，這些