第十三章-分光光度法

第十三章分光光度法第一節(jié)概述分光光度法是利用被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)光的選擇性吸收特性而建立的一種分析方法，屬于光譜分析法。分類：根據(jù)測(cè)定的光的波長(zhǎng)分紫外分光光度法可見(jiàn)分光光度法紅外分光光度法特點(diǎn)：靈敏度高，適用于微量或痕量組分的分析操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度較高、重現(xiàn)性好、應(yīng)用范圍廣一、光的性質(zhì)與波長(zhǎng)范圍光是一種電磁波，具有波粒二象性，即波動(dòng)性和粒子性。光在傳播時(shí)表現(xiàn)了光的波動(dòng)性一定的光波具有一定的波長(zhǎng)、頻率、光速c等參數(shù)來(lái)描述：

c=

光的性質(zhì)續(xù)前：波長(zhǎng)：相鄰兩波峰或波谷之間的距離，波長(zhǎng)的單位可用納米（nm），微米（um）表示：1nm=10-3um=10-6mm=10-7cm=10-9m頻率（

）：是每秒內(nèi)光波的振動(dòng)次數(shù)，單位是赫茲（Hz）續(xù)前光又具有粒子性，是由一顆一顆不連續(xù)的光子構(gòu)成的粒子流，這種粒子叫光子，是量子化的。光子的能量（E）取決于頻率，其關(guān)系為：

E=h=hc/

（h為普朗克常數(shù)：h=6.626×10-34J·S)可見(jiàn)：光的波長(zhǎng)越短（頻率越高），其能量越大。光的分類單色光：僅含某一種波長(zhǎng)的光復(fù)合光：不同波長(zhǎng)的光組合而成。如白光。物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性，若溶液選擇性地吸收了某種顏色的光，則溶液呈吸收光的互補(bǔ)光。波長(zhǎng)范圍：可見(jiàn)光區(qū)：400-760nm復(fù)合光紫外光區(qū)：近紫外區(qū)200-400nm

遠(yuǎn)紫外區(qū)100-200nm

紅外光區(qū)：0.76~500um

近紅外區(qū)：0.76~2.5um

中紅外區(qū)：2.5~50um

遠(yuǎn)紅外區(qū)：50~500um二、分子吸收光譜的產(chǎn)生分子運(yùn)動(dòng)包括：分子外層的價(jià)電子運(yùn)動(dòng)——電子能級(jí)分子內(nèi)原子在平衡位置附近的振動(dòng)——振動(dòng)能級(jí)分子繞重心軸的轉(zhuǎn)動(dòng)——轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)分子能量：電子能量、振動(dòng)能量、轉(zhuǎn)動(dòng)能量之和

E電>E振>E轉(zhuǎn)

高能級(jí)的運(yùn)動(dòng)中包括低能級(jí)的運(yùn)動(dòng)續(xù)前當(dāng)用一定波長(zhǎng)的光線照射試樣時(shí)，其分子選擇吸收了某些具有特定波長(zhǎng)（或頻率）的光子后，由較低能級(jí)（基態(tài)）躍遷到較高能級(jí)（激發(fā)態(tài)）時(shí)，所吸收光子的能量正好等于躍遷前后的能級(jí)差。把分子吸收能量隨波長(zhǎng)變化的情況記錄下來(lái)所得的圖譜為吸收光譜。利用物質(zhì)的吸收光譜進(jìn)行定性、定量及結(jié)構(gòu)分析的方法稱為吸收光譜法，簡(jiǎn)稱光譜法。三、光的吸收定律（一）百分透光率（T）和吸收度（A）入射光I0→吸收Ia→透射ItI0=Ia+It

透光率（描述入射光透過(guò)溶液的程度）

T=It/I0或T%=It/I0×100%

透光率的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度，用符號(hào)A表示。吸光度A=-lgT=lg

I0/ItA愈大，溶液對(duì)光的吸收愈多。（二）朗伯-比爾定律當(dāng)一束平行的單色光通過(guò)均勻、無(wú)散射現(xiàn)象的溶液時(shí)，在單色光強(qiáng)度、溶液的溫度等條件不變的情況下，溶液對(duì)光的吸收度與溶液的濃度及液層厚度的乘積成正比。A=－lgT=ECL

朗伯-比爾定律適用于無(wú)色溶液、有色溶液及氣體和固體的非散射均勻體系。（三）吸收系數(shù)吸光物質(zhì)在單位濃度、單位液層厚度時(shí)的吸收度。當(dāng)溶液的濃度C的單位不同時(shí)，吸收系數(shù)的意義和表示方法也不同，常用的表示方法有兩種：1、摩爾吸收系數(shù)：是指在一定波長(zhǎng)下，溶液濃度為1mol/L，液層厚度為1cm時(shí)的吸收度，用ε表示。2、百分吸收系數(shù)：是指在一定波長(zhǎng)下，溶液濃度為1%（g/ml），液層厚度為1cm時(shí)的吸收度，表示。續(xù)前百分吸收系數(shù)與摩爾吸收系數(shù)之間的關(guān)系是：吸收系數(shù)是物質(zhì)的特性常數(shù)，表明物質(zhì)對(duì)某一特定波長(zhǎng)光的吸收能力。不同物質(zhì)對(duì)同一波長(zhǎng)的單色光有不同的吸收系數(shù)，吸收系數(shù)越大，表明吸光能力越強(qiáng)，靈敏度越高，所以吸收系數(shù)是物質(zhì)定性和定量分析的依據(jù)。四、吸收光譜吸收光譜又稱吸收曲線，是在濃度一定的條件下，以波長(zhǎng)（λ）或波數(shù)（δ）為橫坐標(biāo)，以吸收度（A）為縱坐標(biāo)所描繪的曲線。吸收峰最大吸收波長(zhǎng)λmax

吸收谷最小吸收波長(zhǎng)λmin

肩峰λsh

末端吸收續(xù)前λmax、λmin、λsh及整個(gè)吸收光譜的形狀取決于物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，可作為定性分析的依據(jù)。同一物質(zhì)的吸收光譜應(yīng)有相同的λmax、λmin、λsh；而且在相同濃度時(shí)，同一物質(zhì)的吸收曲線應(yīng)相互重合。第二節(jié)紫外-可見(jiàn)分光光度法一、基本原理物質(zhì)分子受到紫外-可見(jiàn)光的照射，選擇吸收某些適宜能量的光子后，其原子的外層電子（成鍵電子、未成鍵電子）由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，在相應(yīng)波長(zhǎng)的位置出現(xiàn)吸收所形成的光譜，稱為紫外-可見(jiàn)吸收光譜。適用范圍：分子中含有芳環(huán)或共軛雙鍵的有機(jī)藥物，在紫外光區(qū)有特征吸收外觀有顏色的藥物在可見(jiàn)光區(qū)有特征吸收都可用紫外-可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行分析。儀器可見(jiàn)分光光度計(jì)721型分光光度計(jì)儀器紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)一、基本組成光源單色器樣品室檢測(cè)器顯示器1.光源

在整個(gè)紫外光區(qū)或可見(jiàn)光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的使用壽命。

可見(jiàn)光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長(zhǎng)范圍在350～1000nm。

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射200～360nm的連續(xù)光譜。

2.單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長(zhǎng)單色光的光學(xué)系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見(jiàn)區(qū)一般用玻璃池。4.檢測(cè)器

利用光電效應(yīng)將透過(guò)吸收池的光信號(hào)變成可測(cè)的電信號(hào)，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)

檢流計(jì)、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行儀器自動(dòng)控制和結(jié)果處理二、分光光度計(jì)的類型1.單光束

簡(jiǎn)單，價(jià)廉，適于在給定波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測(cè)器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束

自動(dòng)記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測(cè)器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)格較高。3.雙波長(zhǎng)

將不同波長(zhǎng)的兩束單色光(λ1、λ2)快速交替通過(guò)同一吸收池而后到達(dá)檢測(cè)器。產(chǎn)生交流信號(hào)。無(wú)需參比池?！?1～2nm。兩波長(zhǎng)同時(shí)掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。三種分光光度計(jì)的比較721型分光光度計(jì)的使用第三節(jié)藥物分析中含量測(cè)定和微量雜質(zhì)的檢查紫外可見(jiàn)分光光度法是藥物分析中的一種重要的方法，常用語(yǔ)藥物鑒別、檢查和含量測(cè)定（一）定性鑒別根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜特征，如吸收光譜的形狀、最大吸收波長(zhǎng)、吸收峰數(shù)目、各吸收峰的位置，強(qiáng)度和相應(yīng)的吸收系數(shù)等進(jìn)行分析。1、比較光譜的一致性兩個(gè)化合物相同，在相同的條件下測(cè)出的吸收光譜應(yīng)完全相同。具體做法：（1）樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在完全相同的情況下，分別測(cè)出吸收光譜，比較二者光譜是否一致（2）沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品，用標(biāo)準(zhǔn)光譜圖對(duì)歸照比較，二者吸收光譜一致，可初步斷定是同一化合物。注意：結(jié)構(gòu)完全相同的物質(zhì)，其吸收光譜完全一致，但吸收光譜完全相同的物質(zhì)卻不一定是同一物質(zhì)。

2、比較吸收光譜特征數(shù)據(jù)的一致性常用最大吸收波長(zhǎng)和吸收系數(shù)不同的化合物，可有相同的最大吸收波長(zhǎng)，但因分子量不同，其百分吸收系數(shù)有明顯的差異。3、比較吸收度或吸收系數(shù)比值的一致性適用于吸收峰較多的藥物，各吸收峰對(duì)應(yīng)的吸收度或吸收系數(shù)的比值是一定的，可作為鑒別的標(biāo)準(zhǔn)。用分光光度法進(jìn)行鑒別時(shí)的要求:

儀器必須按要求嚴(yán)格校正合格后方可使用樣品的純度必須達(dá)到要求才能測(cè)定一、含量測(cè)定1、吸收系數(shù)法：（1）利用待測(cè)物質(zhì)的吸收系數(shù)與測(cè)得的一定濃度時(shí)的吸收度比較計(jì)算含量的方法，又稱絕對(duì)法。根據(jù)朗伯-比爾定律A=ECL，得：例1已知維生素B12在361nm處的E值是207，現(xiàn)測(cè)得維生素B12水溶液的吸收度為0.414，吸收池厚度為1cm，求該溶液的濃度。解：即該溶液的濃度為0.002%（g/ml），即100ml維生素B12水溶液中含維生素B120.002g。1、吸收系數(shù)法：（2）按各品種項(xiàng)下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收系數(shù)計(jì)算含量。例2精密稱取維生素B12供試品25.0mg，加水溶解并稀釋制成1000ml，于1cm厚的吸收池中，在361nm處測(cè)得吸收度為0.507，按C68H88CoN14O14P的為207計(jì)算，求維生素B12的含量百分比。

解：2、標(biāo)準(zhǔn)曲線法是分光光度法中最經(jīng)典的方法。特點(diǎn)：對(duì)儀器要求不高，是分光光度法中簡(jiǎn)便易行的方法。步驟：（1）標(biāo)準(zhǔn)系列：先用于待測(cè)物質(zhì)組分相同的標(biāo)準(zhǔn)品，配成一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同條件下，分別測(cè)定其吸收度。（2）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以濃度C為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸收度A為縱坐標(biāo)，繪制A-C曲線，稱為工作曲線。（3）查找：在相同條件下，測(cè)出供試品溶液的吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上便可查出與此吸收度值相應(yīng)的供試品溶液的濃度。注意事項(xiàng)：1、標(biāo)準(zhǔn)系列的數(shù)目應(yīng)在四個(gè)伊桑2、注明時(shí)間、測(cè)定項(xiàng)目和條件3、條件發(fā)生改變時(shí)，應(yīng)重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線3、對(duì)照品比較法在相同條件下，配制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品和供試品溶液，在選定的波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度A標(biāo)和A供。根據(jù)：A標(biāo)=EC標(biāo)LA供=EC供L

標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品與供試品是同一種物質(zhì)，在同一儀器、同一波長(zhǎng)下測(cè)定，因此L和E相等。例3精密稱取奧沙西泮供試品與對(duì)照品各15mg，加乙醇溶解并稀釋至200ml，再精密量取5ml，置100ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，在229nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度分別為：A供=0.462，A標(biāo)=0.470，求奧沙西泮的含量。解：供試品與標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下配制與測(cè)定，C標(biāo)=C原續(xù)前優(yōu)點(diǎn)：對(duì)照法采用對(duì)照品與供試品平行操作的方式，具有消除儀器與方法誤差的優(yōu)點(diǎn)，是中國(guó)藥典中采用較多的方法。二、微量雜質(zhì)的檢查方法雜質(zhì)：任何影響藥品純度的物質(zhì)均稱雜質(zhì)，可在生產(chǎn)中或運(yùn)輸中產(chǎn)生雜質(zhì)檢查也叫純度檢查藥物中微量雜質(zhì)的檢查方法較多用比色法和分光光度法

（一）、比色法常用來(lái)檢查無(wú)機(jī)雜質(zhì)離子。應(yīng)用：利用雜質(zhì)離子與其他物質(zhì)生成有色物質(zhì)或生成難溶物使得溶液渾濁，再與標(biāo)準(zhǔn)品比較。目視比色法是用眼睛辨別、比較供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的顏色深