分子發(fā)光分析法

第五章分子發(fā)光分析法

MolecularLuminescence物質(zhì)分子吸收了外界能量后，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當處于激發(fā)態(tài)的分子以輻射躍遷的方式返回基態(tài)時，就產(chǎn)生了分子發(fā)光。分子發(fā)光包括熒光、磷光、化學發(fā)光、生物發(fā)光和散射光譜等。一、概述分子熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的分子熒光光譜進行定性，以熒光強度進行定量的一種分析方法熒光分析法的特點：1.與紫外-可見分光度法比較，熒光分析法具有更高的靈敏度2.選擇性好熒光法既能依據(jù)發(fā)射光譜，又能依據(jù)吸收光譜來鑒定物質(zhì)3.所需試樣量少、操作方法簡便4.能提供較的多分析參數(shù)、信息量大熒光分析法的缺點：應用范圍不夠廣泛第一節(jié)熒光分析方法（1）分子能級

每個分子都有一系列不同的電子能級，在每個電子能級中又包含一系列的振動能級和轉(zhuǎn)動能級

基態(tài)與激發(fā)態(tài)單重態(tài)與三重態(tài)

1.熒光的產(chǎn)生二、基本原理

M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應單重態(tài)能級低大多數(shù)有機分子的基態(tài)處于單重態(tài)電子激發(fā)態(tài)的多重度（2）分子能級躍遷基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢激發(fā)態(tài)→基態(tài)的躍遷

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強度相對大傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛豫無輻射躍遷振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10-12―10-14s內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)電子能級中,不同電子能級間的無輻射躍遷通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。10-11―10-13s外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進行非輻射能量傳遞過程輻射能量傳遞過程熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)(多為S1→S0

躍遷)；10-7～10-9

s磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)(T1→S0躍遷)

電子由S0進入T1的可能過程：

S0

→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動弛豫→T1

T1→S0躍遷為禁阻躍遷，故發(fā)光速度很慢：10-4～100s

光照停止后，可持續(xù)一段時間2.熒光效率及其影響因素（1）熒光效率（量子產(chǎn)率）通常用下式表示：

在產(chǎn)生熒光的過程中，有許多影響熒光強度的過程，如熒光發(fā)射、內(nèi)轉(zhuǎn)換，系間竄躍和外轉(zhuǎn)換?？梢杂脭?shù)學式來表達這些關系，得到：其中kf為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，ki為其它有關過程的速率常數(shù)總和熒光物質(zhì)必須含有強吸光基團

(a)躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生(b)共軛效應：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移熒光物質(zhì)必須具有剛性平面結構（2）熒光與分子結構的關系

分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個條件：

(c)

剛性平面結構：可減少分子振動，減少與溶劑的相互作用(d)取代基效應：給電子取代基使熒光增強；吸電子取代基使熒光減弱如苯胺和苯酚熒光較強，而硝基苯為非熒光物質(zhì)（e）重原子效應：鹵素取代基隨原子序數(shù)的增加，熒光減弱，而磷光增強（3)熒光螯合物

不少有機化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結構，分子處于非同一平面，因而不發(fā)生熒光。若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的剛性增強，平面結構的增大，常會發(fā)生熒光如8-羥基喹啉本身有很弱的熒光，但其金屬螯合物具有很強的熒光（a）溶劑的影響隨溶劑極性增強，激發(fā)態(tài)穩(wěn)定性增加，熒光增強此外，氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化（b）溫度的影響熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加（c）溶液pH

對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制（d）表面活性劑：膠束增溶、增穩(wěn)、增敏作用（e）溶液中溶解氧的影響：氧分子的順磁性使激發(fā)態(tài)單重態(tài)向三重態(tài)得體系間竄躍速率加大，熒光減弱

(4)影響熒光強度的外部因素根據(jù)熒光量子產(chǎn)率的定義，熒光強度If等于吸收的光量Ia與熒光量子產(chǎn)率的乘積：If

=

Ia由于可得當A<0.05時，簡化為：3.熒光強度與溶液濃度的關系

對于一給定物質(zhì)，當激發(fā)光波長和強度一定時，熒光強度只與溶液濃度有關：這種線性關系只有在極稀的溶液中才成立。對于較濃的溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強度與濃度不成線性關系經(jīng)常遇到的自淬滅現(xiàn)象有兩種：（1）當熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光通過溶液時被熒光物質(zhì)的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象。（2）由于激發(fā)態(tài)分子之間的碰撞，導致非輻射躍遷概率增大，熒光效率降低。熒光猝滅：熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子之間所發(fā)生的導致熒光強度下降的物理或化學作用過程熒光自猝滅效應：由熒光物質(zhì)自身引起的熒光強度減弱的現(xiàn)象（1）激發(fā)光譜

固定測量波長(選最大發(fā)射波長)，化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與照射光波長的關系曲線。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大（2）發(fā)射光譜固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關系曲線(圖中曲線II或III)4.激發(fā)光譜和發(fā)射光譜萘的激發(fā)(I)光譜熒光(II)和磷光(III)光譜圖熒光發(fā)射光譜的普遍特性：（1）Stokes位移

在溶液中，分子熒光的發(fā)射相對于吸收位移到較長的波長，稱為Stokes位移。這是由于受激分子通過振動弛豫而失去轉(zhuǎn)動能，也由于溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞，也會有能量的損失（2）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關因為分子吸收了不同能量的光子可以由基態(tài)激發(fā)到幾個不同的電子激發(fā)態(tài)，而具有幾個吸收帶。由于較高激發(fā)態(tài)通過內(nèi)轉(zhuǎn)換及轉(zhuǎn)動弛豫回到第一電子激發(fā)態(tài)的幾率較高，遠大于由高能激發(fā)態(tài)直接發(fā)射光子的速度，故在熒光發(fā)射時，不論用哪一個波長的光輻射激發(fā)，電子都從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能層返回到基態(tài)的各個振動能層，所以熒光發(fā)射光譜與激發(fā)波長無關（3）鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜和它的吸收光譜呈鏡像對稱關系基態(tài)中振動能層的分布和第一電子激發(fā)態(tài)中振動能層的分布情況是類似的。因此熒光光譜的形狀和吸收光譜的形狀極為相似三、熒光分析儀器

常用于測量熒光的儀器以下五個部件構成：激發(fā)光源、樣品池、用于選擇激發(fā)光波長和熒光波長的單色器以及檢測器為了消除入射光和散射光的影響，熒光的測量通常在與激發(fā)光成直角的方向上進行第一單色器或濾光片記錄儀第二單色器或濾光片熒光光源激發(fā)樣品池1.光源

在熒光計中常用鹵鎢燈作光源熒光分度計常采用高壓汞燈或氙弧燈做光源可調(diào)諧染料激光器2.單色器

熒光計的單色器是濾光片，只能用于定量分析熒光分光光度計采用兩個光柵單色器，可獲得激發(fā)光譜和熒光光譜3.檢測器

熒光計采用光電管作檢測器熒光分光光度計采用光電倍增管作檢測器電感耦合器件（chargecoupledevice,CCD)四、熒光分析方法與應用1.

特點：（1）靈敏度高

比紫外-可見分光光度法高2～4個數(shù)量級光度法A=lgI0/I=KC

熒光法I=KC（2）選擇性強既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜（3）試樣量少？(1)無機化合物的分析與有機試劑配合后測量；可測量約70多種元素(2)有機化合物的分析脂肪族有機化合物一般需要與某些試劑反應后才能進行熒光分析芳香族化合物多數(shù)能發(fā)生熒光，可以直接用熒光法測定2.熒光分析法的應用熒光標記物和熒光探針MolecularFormula:C21H11NO5S

CASNumber/Name:

3326-32-7/Spiro(isobenzofuran-1(3H),9'-(9H)xanthen)-3-one,3',6'-dihydroxy-5-isothiocyanato-fluorescein-5-isothiocyanate(FITC)

一、基本原理1.磷光的產(chǎn)生和磷光強度

磷光是由處于激發(fā)三重態(tài)的分子躍遷返回基態(tài)時所產(chǎn)生的輻射。與熒光比較，磷光的特點：（1）磷光輻射的波長比熒光長（2）磷光具有較長的壽命（3）磷光的壽命和輻射強度對于重原子和順磁性離子非常敏感第二節(jié)磷光分析法當磷光物質(zhì)濃度很小時，磷光強度Ip與磷光物質(zhì)濃度c之間的關系為：式中：Ip

為磷光效率，Io為激發(fā)光的強度人為磷光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)，b為試樣池的光程。在一定的條件下，、、、b均為常數(shù)，因此上式可寫成：根據(jù)上式可以用磷光強度對磷光物質(zhì)濃度制作定量分析的標準曲線2.溫度對磷光強度的影響：隨著溫度的降低，磷光逐漸增強3.重原子效應：重原子的高核電荷使磷光分子的電子能級交錯，容易引起或增強磷光分子的自旋軌道偶合作用，從而使S1→T1的體系間竄躍概率增大，有利于增大磷光效率。4.室溫磷光（1）固體基質(zhì)：在室溫下以固體基質(zhì)吸附磷光體，增加分子剛性、減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率。（2）膠束增穩(wěn)：利用表面活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變磷光體的微環(huán)境、增加定向約束力，從而減小內(nèi)轉(zhuǎn)換和碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性。（3）敏化磷光:激發(fā)三重態(tài)將能量轉(zhuǎn)移于另一易發(fā)磷光的受體，讓其發(fā)磷光1．樣品池盛試液的石英液槽需放置在盛液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)2．磷光鏡利用磷光鏡不僅可分別測出熒光和磷光強度，而且可以測出不同壽命的磷光二、磷光分析儀器

熒光計上配上磷光測量附件即可對磷光進行測量。在有熒光發(fā)射的同時測量磷光a.低溫杜瓦瓶b.斬光片第三節(jié)化學發(fā)光與生物發(fā)光分析

一、概述

化學發(fā)光指由化學反應能，激發(fā)物質(zhì)分子所產(chǎn)生的光輻射。生物發(fā)光指生物體系中的化學發(fā)光。

優(yōu)點：靈敏度高、儀器簡單、線性范圍寬、分析速度快。缺點：能用于化學發(fā)光與生物發(fā)光分析的試劑相對有限，對發(fā)光機理的研究較少。生物發(fā)光具有很高的發(fā)光效率。常用的化學發(fā)光效率較低，一般在0.01以下。

螢火蟲植物Pyrocystis

fusiformis

1.化學發(fā)光反應的條件：（1）化學反應必須能放出足夠的能量；（2）化學反應所釋放的能量能夠用于產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子；（3）處于激發(fā)態(tài)的分子以輻射躍遷的形式返回基態(tài)。二、化學發(fā)光的基本原理

A+B→C*+DC*→C+

hν化學發(fā)光效率φCL定義為：生成激發(fā)態(tài)分子的化學效率φr：生成激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率φf：

2.化學發(fā)光效率和發(fā)光強度化學效率φr主要取決于發(fā)光所依賴的化學反應本身；而發(fā)光效率φf既取決于發(fā)光體本身的結構和性質(zhì)，亦受環(huán)境的影響。

對于一級動力學反應，化學發(fā)光強度ICL與反應速率有如下關系：積分，得：

由上式可知：在一定條件下，發(fā)光總強度與分析物濃度成正比。因此，根據(jù)已知時間內(nèi)的發(fā)光總強度可進行化學發(fā)光分析的定量分析。3.化學發(fā)光反應的類型（1）液相化學發(fā)光

魯米諾+H2O2

產(chǎn)物+hv

魯米諾在堿性溶液中被H2O2、I2等氧化劑氧化，可產(chǎn)生最大波長為425nm的光輻射。(2)氣相化學發(fā)光

在氣相中，O3能氧化NO、乙烯等產(chǎn)生化學發(fā)光，原子氧也能氧化SO2、NO、CO等產(chǎn)生化學發(fā)光。例如：a.一氧化氮與O3的發(fā)光反應

NO+O3

→NO2*

NO2*→NO2+h

發(fā)射的光譜范圍：600～875nm，靈敏度1ng/cm-3；b.氧原子與CO的發(fā)光反應：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h

發(fā)射光譜范圍：300～500nm；靈敏度1ng/cm-3。三、化學發(fā)光分析的儀器1.分立取樣式儀器分立式化學發(fā)光分析儀是一種靜態(tài)下測量液相化學發(fā)光信號的裝置。特點：儀器簡單、靈敏度高，可用于反應動力學的研究。缺點：重復性差，測量的精密度不高，難于實現(xiàn)自動化，分析效率也比較低。放大器數(shù)字顯示器高壓穩(wěn)壓電源記錄儀分立取樣式化學發(fā)光儀器示意圖1－反應器2－反應池3－恒溫水箱4－貯液管5－濾光片6－光電倍增管驅(qū)動裝置發(fā)光試劑2.流動注射式儀器流動注射式化學發(fā)光分析儀示意圖用蠕動泵分別將試劑連續(xù)送入混合器，定時通過測量室，連續(xù)發(fā)光，測定光強度；試樣量大。載流樣品采樣閥反應池光電倍增管記錄顯示廢液四、化學發(fā)光分析的應用氣相化學發(fā)光已廣泛地應用于大氣中O3、NO、NO2、H2S、SO2、CO等組分的監(jiān)測。魯米諾-H2O2化學發(fā)光反應能被許多過渡金屬離子所催化，利用這一性質(zhì)，已建立了Co2+、Cr3+、Cu2+、Au3+、Ag+、Fe(Ⅱ、Ⅲ)、Ni2+、Mn2+、Os(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)、Ru(Ⅳ)、Ir(Ⅳ)、Rh(Ⅲ)、v(Ⅴ)等金屬離子的化學發(fā)光分析法此外，Hg2+、Ce(Ⅳ)、Ti(Ⅳ)等金屬離子和CN-、S2-等非金屬離子對魯米諾-H2O2體系的化學發(fā)光具有抑制作用，利用抑制作用也可對這些離子進行測定。魯米諾-H2O2體系也用于化學發(fā)光法測定許多生化物質(zhì)，如甘氨酸、鐵蛋白、血紅蛋白、肌紅蛋白等。特別是與酶反應結合，可用于分析葡萄糠、乳酸、氨基酸等。五、生物發(fā)光分析法

在生物發(fā)光分析中，通常同時涉及到酶促反應和發(fā)光反應。這類發(fā)光分析法不僅靈敏度高，選擇性也很高。例如三磷酸腺苷（ATP）的測定，就是生物發(fā)光分析的成功實例。在pH為7-8的介質(zhì)中，在熒光蟲素酶（E）和Mg（Ⅱ）離子的存在下，熒光蟲素（LH2）與ATP反應，生成磷酸腺苷（AMP）熒光蟲素和熒光蟲素酸的復合物及鎂的焦磷酸鹽（ppi）。