分子發(fā)光分析法

第五章分子發(fā)光分析法

MolecularLuminescence物質(zhì)分子吸收了外界能量后，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)處于激發(fā)態(tài)的分子以輻射躍遷的方式返回基態(tài)時(shí)，就產(chǎn)生了分子發(fā)光。分子發(fā)光包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和散射光譜等。一、概述分子熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的分子熒光光譜進(jìn)行定性，以熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量的一種分析方法熒光分析法的特點(diǎn)：1.與紫外-可見(jiàn)分光度法比較，熒光分析法具有更高的靈敏度2.選擇性好熒光法既能依據(jù)發(fā)射光譜，又能依據(jù)吸收光譜來(lái)鑒定物質(zhì)3.所需試樣量少、操作方法簡(jiǎn)便4.能提供較的多分析參數(shù)、信息量大熒光分析法的缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍不夠廣泛第一節(jié)熒光分析方法（1）分子能級(jí)

每個(gè)分子都有一系列不同的電子能級(jí)，在每個(gè)電子能級(jí)中又包含一系列的振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)

基態(tài)與激發(fā)態(tài)單重態(tài)與三重態(tài)

1.熒光的產(chǎn)生二、基本原理

M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)電子激發(fā)態(tài)的多重度（2）分子能級(jí)躍遷基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見(jiàn)能級(jí)圖)速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)激發(fā)態(tài)→基態(tài)的躍遷

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射躍遷(發(fā)光)和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫無(wú)輻射躍遷振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12―10-14s內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)電子能級(jí)中,不同電子能級(jí)間的無(wú)輻射躍遷通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。10-11―10-13s外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過(guò)自旋—軌道耦合進(jìn)行非輻射能量傳遞過(guò)程輻射能量傳遞過(guò)程熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)(多為S1→S0

躍遷)；10-7～10-9

s磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)(T1→S0躍遷)

電子由S0進(jìn)入T1的可能過(guò)程：

S0

→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動(dòng)弛豫→T1

T1→S0躍遷為禁阻躍遷，故發(fā)光速度很慢：10-4～100s

光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間2.熒光效率及其影響因素（1）熒光效率（量子產(chǎn)率）通常用下式表示：

在產(chǎn)生熒光的過(guò)程中，有許多影響熒光強(qiáng)度的過(guò)程，如熒光發(fā)射、內(nèi)轉(zhuǎn)換，系間竄躍和外轉(zhuǎn)換。可以用數(shù)學(xué)式來(lái)表達(dá)這些關(guān)系，得到：其中kf為熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)，ki為其它有關(guān)過(guò)程的速率常數(shù)總和熒光物質(zhì)必須含有強(qiáng)吸光基團(tuán)

(a)躍遷類(lèi)型：*→的熒光效率高，系間跨越過(guò)程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生(b)共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移熒光物質(zhì)必須具有剛性平面結(jié)構(gòu)（2）熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件：

(c)

剛性平面結(jié)構(gòu)：可減少分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用(d)取代基效應(yīng)：給電子取代基使熒光增強(qiáng)；吸電子取代基使熒光減弱如苯胺和苯酚熒光較強(qiáng)，而硝基苯為非熒光物質(zhì)（e）重原子效應(yīng)：鹵素取代基隨原子序數(shù)的增加，熒光減弱，而磷光增強(qiáng)（3)熒光螯合物

不少有機(jī)化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結(jié)構(gòu)，分子處于非同一平面，因而不發(fā)生熒光。若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的剛性增強(qiáng)，平面結(jié)構(gòu)的增大，常會(huì)發(fā)生熒光如8-羥基喹啉本身有很弱的熒光，但其金屬螯合物具有很強(qiáng)的熒光（a）溶劑的影響隨溶劑極性增強(qiáng)，激發(fā)態(tài)穩(wěn)定性增加，熒光增強(qiáng)此外，氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化（b）溫度的影響熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加（c）溶液pH

對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制（d）表面活性劑：膠束增溶、增穩(wěn)、增敏作用（e）溶液中溶解氧的影響：氧分子的順磁性使激發(fā)態(tài)單重態(tài)向三重態(tài)得體系間竄躍速率加大，熒光減弱

(4)影響熒光強(qiáng)度的外部因素根據(jù)熒光量子產(chǎn)率的定義，熒光強(qiáng)度If等于吸收的光量Ia與熒光量子產(chǎn)率的乘積：If

=

Ia由于可得當(dāng)A<0.05時(shí)，簡(jiǎn)化為：3.熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系

對(duì)于一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度一定時(shí)，熒光強(qiáng)度只與溶液濃度有關(guān)：這種線(xiàn)性關(guān)系只有在極稀的溶液中才成立。對(duì)于較濃的溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度與濃度不成線(xiàn)性關(guān)系經(jīng)常遇到的自淬滅現(xiàn)象有兩種：（1）當(dāng)熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光通過(guò)溶液時(shí)被熒光物質(zhì)的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象。（2）由于激發(fā)態(tài)分子之間的碰撞，導(dǎo)致非輻射躍遷概率增大，熒光效率降低。熒光猝滅：熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子之間所發(fā)生的導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降的物理或化學(xué)作用過(guò)程熒光自猝滅效應(yīng)：由熒光物質(zhì)自身引起的熒光強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象（1）激發(fā)光譜

固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng))，化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線(xiàn)。激發(fā)光譜曲線(xiàn)的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大（2）發(fā)射光譜固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線(xiàn)(圖中曲線(xiàn)II或III)4.激發(fā)光譜和發(fā)射光譜萘的激發(fā)(I)光譜熒光(II)和磷光(III)光譜圖熒光發(fā)射光譜的普遍特性：（1）Stokes位移

在溶液中，分子熒光的發(fā)射相對(duì)于吸收位移到較長(zhǎng)的波長(zhǎng)，稱(chēng)為Stokes位移。這是由于受激分子通過(guò)振動(dòng)弛豫而失去轉(zhuǎn)動(dòng)能，也由于溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞，也會(huì)有能量的損失（2）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)因?yàn)榉肿游樟瞬煌芰康墓庾涌梢杂苫鶓B(tài)激發(fā)到幾個(gè)不同的電子激發(fā)態(tài)，而具有幾個(gè)吸收帶。由于較高激發(fā)態(tài)通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換及轉(zhuǎn)動(dòng)弛豫回到第一電子激發(fā)態(tài)的幾率較高，遠(yuǎn)大于由高能激發(fā)態(tài)直接發(fā)射光子的速度，故在熒光發(fā)射時(shí)，不論用哪一個(gè)波長(zhǎng)的光輻射激發(fā)，電子都從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層返回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層，所以熒光發(fā)射光譜與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)（3）鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜和它的吸收光譜呈鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系基態(tài)中振動(dòng)能層的分布和第一電子激發(fā)態(tài)中振動(dòng)能層的分布情況是類(lèi)似的。因此熒光光譜的形狀和吸收光譜的形狀極為相似三、熒光分析儀器

常用于測(cè)量熒光的儀器以下五個(gè)部件構(gòu)成：激發(fā)光源、樣品池、用于選擇激發(fā)光波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)的單色器以及檢測(cè)器為了消除入射光和散射光的影響，熒光的測(cè)量通常在與激發(fā)光成直角的方向上進(jìn)行第一單色器或?yàn)V光片記錄儀第二單色器或?yàn)V光片熒光光源激發(fā)樣品池1.光源

在熒光計(jì)中常用鹵鎢燈作光源熒光分度計(jì)常采用高壓汞燈或氙弧燈做光源可調(diào)諧染料激光器2.單色器

熒光計(jì)的單色器是濾光片，只能用于定量分析熒光分光光度計(jì)采用兩個(gè)光柵單色器，可獲得激發(fā)光譜和熒光光譜3.檢測(cè)器

熒光計(jì)采用光電管作檢測(cè)器熒光分光光度計(jì)采用光電倍增管作檢測(cè)器電感耦合器件（chargecoupledevice,CCD)四、熒光分析方法與應(yīng)用1.

特點(diǎn)：（1）靈敏度高

比紫外-可見(jiàn)分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)光度法A=lgI0/I=KC

熒光法I=KC（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜（3）試樣量少？(1)無(wú)機(jī)化合物的分析與有機(jī)試劑配合后測(cè)量；可測(cè)量約70多種元素(2)有機(jī)化合物的分析脂肪族有機(jī)化合物一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析芳香族化合物多數(shù)能發(fā)生熒光，可以直接用熒光法測(cè)定2.熒光分析法的應(yīng)用熒光標(biāo)記物和熒光探針MolecularFormula:C21H11NO5S

CASNumber/Name:

3326-32-7/Spiro(isobenzofuran-1(3H),9'-(9H)xanthen)-3-one,3',6'-dihydroxy-5-isothiocyanato-fluorescein-5-isothiocyanate(FITC)

一、基本原理1.磷光的產(chǎn)生和磷光強(qiáng)度

磷光是由處于激發(fā)三重態(tài)的分子躍遷返回基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的輻射。與熒光比較，磷光的特點(diǎn)：（1）磷光輻射的波長(zhǎng)比熒光長(zhǎng)（2）磷光具有較長(zhǎng)的壽命（3）磷光的壽命和輻射強(qiáng)度對(duì)于重原子和順磁性離子非常敏感第二節(jié)磷光分析法當(dāng)磷光物質(zhì)濃度很小時(shí)，磷光強(qiáng)度Ip與磷光物質(zhì)濃度c之間的關(guān)系為：式中：Ip

為磷光效率，Io為激發(fā)光的強(qiáng)度人為磷光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)，b為試樣池的光程。在一定的條件下，、、、b均為常數(shù)，因此上式可寫(xiě)成：根據(jù)上式可以用磷光強(qiáng)度對(duì)磷光物質(zhì)濃度制作定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)2.溫度對(duì)磷光強(qiáng)度的影響：隨著溫度的降低，磷光逐漸增強(qiáng)3.重原子效應(yīng)：重原子的高核電荷使磷光分子的電子能級(jí)交錯(cuò)，容易引起或增強(qiáng)磷光分子的自旋軌道偶合作用，從而使S1→T1的體系間竄躍概率增大，有利于增大磷光效率。4.室溫磷光（1）固體基質(zhì)：在室溫下以固體基質(zhì)吸附磷光體，增加分子剛性、減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率。（2）膠束增穩(wěn)：利用表面活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變磷光體的微環(huán)境、增加定向約束力，從而減小內(nèi)轉(zhuǎn)換和碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性。（3）敏化磷光:激發(fā)三重態(tài)將能量轉(zhuǎn)移于另一易發(fā)磷光的受體，讓其發(fā)磷光1．樣品池盛試液的石英液槽需放置在盛液氮的石英杜瓦瓶?jī)?nèi)2．磷光鏡利用磷光鏡不僅可分別測(cè)出熒光和磷光強(qiáng)度，而且可以測(cè)出不同壽命的磷光二、磷光分析儀器

熒光計(jì)上配上磷光測(cè)量附件即可對(duì)磷光進(jìn)行測(cè)量。在有熒光發(fā)射的同時(shí)測(cè)量磷光a.低溫杜瓦瓶b.斬光片第三節(jié)化學(xué)發(fā)光與生物發(fā)光分析

一、概述

化學(xué)發(fā)光指由化學(xué)反應(yīng)能，激發(fā)物質(zhì)分子所產(chǎn)生的光輻射。生物發(fā)光指生物體系中的化學(xué)發(fā)光。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、儀器簡(jiǎn)單、線(xiàn)性范圍寬、分析速度快。缺點(diǎn)：能用于化學(xué)發(fā)光與生物發(fā)光分析的試劑相對(duì)有限，對(duì)發(fā)光機(jī)理的研究較少。生物發(fā)光具有很高的發(fā)光效率。常用的化學(xué)發(fā)光效率較低，一般在0.01以下。

螢火蟲(chóng)植物Pyrocystis

fusiformis

1.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件：（1）化學(xué)反應(yīng)必須能放出足夠的能量；（2）化學(xué)反應(yīng)所釋放的能量能夠用于產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子；（3）處于激發(fā)態(tài)的分子以輻射躍遷的形式返回基態(tài)。二、化學(xué)發(fā)光的基本原理

A+B→C*+DC*→C+

hν化學(xué)發(fā)光效率φCL定義為：生成激發(fā)態(tài)分子的化學(xué)效率φr：生成激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率φf(shuō)：

2.化學(xué)發(fā)光效率和發(fā)光強(qiáng)度化學(xué)效率φr主要取決于發(fā)光所依賴(lài)的化學(xué)反應(yīng)本身；而發(fā)光效率φf(shuō)既取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，亦受環(huán)境的影響。

對(duì)于一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度ICL與反應(yīng)速率有如下關(guān)系：積分，得：

由上式可知：在一定條件下，發(fā)光總強(qiáng)度與分析物濃度成正比。因此，根據(jù)已知時(shí)間內(nèi)的發(fā)光總強(qiáng)度可進(jìn)行化學(xué)發(fā)光分析的定量分析。3.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類(lèi)型（1）液相化學(xué)發(fā)光

魯米諾+H2O2

產(chǎn)物+hv

魯米諾在堿性溶液中被H2O2、I2等氧化劑氧化，可產(chǎn)生最大波長(zhǎng)為425nm的光輻射。(2)氣相化學(xué)發(fā)光

在氣相中，O3能氧化NO、乙烯等產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，原子氧也能氧化SO2、NO、CO等產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。例如：a.一氧化氮與O3的發(fā)光反應(yīng)

NO+O3

→NO2*

NO2*→NO2+h

發(fā)射的光譜范圍：600～875nm，靈敏度1ng/cm-3；b.氧原子與CO的發(fā)光反應(yīng)：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h

發(fā)射光譜范圍：300～500nm；靈敏度1ng/cm-3。三、化學(xué)發(fā)光分析的儀器1.分立取樣式儀器分立式化學(xué)發(fā)光分析儀是一種靜態(tài)下測(cè)量液相化學(xué)發(fā)光信號(hào)的裝置。特點(diǎn)：儀器簡(jiǎn)單、靈敏度高，可用于反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究。缺點(diǎn)：重復(fù)性差，測(cè)量的精密度不高，難于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，分析效率也比較低。放大器數(shù)字顯示器高壓穩(wěn)壓電源記錄儀分立取樣式化學(xué)發(fā)光儀器示意圖1－反應(yīng)器2－反應(yīng)池3－恒溫水箱4－貯液管5－濾光片6－光電倍增管驅(qū)動(dòng)裝置發(fā)光試劑2.流動(dòng)注射式儀器流動(dòng)注射式化學(xué)發(fā)光分析儀示意圖用蠕動(dòng)泵分別將試劑連續(xù)送入混合器，定時(shí)通過(guò)測(cè)量室，連續(xù)發(fā)光，測(cè)定光強(qiáng)度；試樣量大。載流樣品采樣閥反應(yīng)池光電倍增管記錄顯示廢液四、化學(xué)發(fā)光分析的應(yīng)用氣相化學(xué)發(fā)光已廣泛地應(yīng)用于大氣中O3、NO、NO2、H2S、SO2、CO等組分的監(jiān)測(cè)。魯米諾-H2O2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)能被許多過(guò)渡金屬離子所催化，利用這一性質(zhì)，已建立了Co2+、Cr3+、Cu2+、Au3+、Ag+、Fe(Ⅱ、Ⅲ)、Ni2+、Mn2+、Os(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)、Ru(Ⅳ)、Ir(Ⅳ)、Rh(Ⅲ)、v(Ⅴ)等金屬離子的化學(xué)發(fā)光分析法此外，Hg2+、Ce(Ⅳ)、Ti(Ⅳ)等金屬離子和CN-、S2-等非金屬離子對(duì)魯米諾-H2O2體系的化學(xué)發(fā)光具有抑制作用，利用抑制作用也可對(duì)這些離子進(jìn)行測(cè)定。魯米諾-H2O2體系也用于化學(xué)發(fā)光法測(cè)定許多生化物質(zhì)，如甘氨酸、鐵蛋白、血紅蛋白、肌紅蛋白等。特別是與酶反應(yīng)結(jié)合，可用于分析葡萄糠、乳酸、氨基酸等。五、生物發(fā)光分析法

在生物發(fā)光分析中，通常同時(shí)涉及到酶促反應(yīng)和發(fā)光反應(yīng)。這類(lèi)發(fā)光分析法不僅靈敏度高，選擇性也很高。例如三磷酸腺苷（ATP）的測(cè)定，就是生物發(fā)光分析的成功實(shí)例。在pH為7-8的介質(zhì)中，在熒光蟲(chóng)素酶（E）和Mg（Ⅱ）離子的存在下，熒光蟲(chóng)素（LH2）與ATP反應(yīng)，生成磷酸腺苷（AMP）熒光蟲(chóng)素和熒光蟲(chóng)素酸的復(fù)合物及鎂的焦磷酸鹽（ppi）。