PCR原理及各類PCR儀

PCR原理及各類PCR儀PCR原理PCR全稱是PolymeraseChainReaction，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種用于體外擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA通過復(fù)制大幅增加。PCR技術(shù)發(fā)展歷程普通PCR（梯度）熒光定量PCR數(shù)字PCR普通PCR（梯度）簡(jiǎn)單進(jìn)行DNA復(fù)制擴(kuò)增，然后可用電泳或者紫外分光光度計(jì)進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。目的：大量獲得復(fù)制的DNA產(chǎn)物普通PCR儀（梯度PCR儀）其實(shí)就是一臺(tái)溫控儀！關(guān)鍵部件是溫控模塊！PCR反應(yīng)圖解和要素要素1、模板DNA2、dNTP3、Taq酶4、引物5、精確的變化的溫度衡量普通PCR儀的參數(shù)

（以thermo的Arktik為例）樣品模塊規(guī)格：96×0.2ml、384×0.03ml、雙48孔×0.2ml溫度梯度范圍：1-30℃升降溫速率：>3℃/s溫度均一性：±0.4℃（95℃時(shí)）溫度精確性度：±0.3℃溫控范圍：4-99.9℃熱蓋溫控范圍：30-110℃可調(diào)用戶界面：反應(yīng)曲線圖顯示尺寸重量電壓數(shù)據(jù)交換（USB接口）保質(zhì)期PCR儀三種控溫方法的區(qū)別

（calculated、block、probe）

以bio-rad的PCT-200型PCR儀為例：

A）計(jì)算控制（calculated）

計(jì)算控制在運(yùn)行大多數(shù)程序中是最好的溫度控制方法，具有較好

的溫度一致性、可靠性。用計(jì)算控制時(shí)，儀器通過對(duì)樣品的管子或玻

片熱傳導(dǎo)的速度和樣品體積進(jìn)行模塊溫度估算（當(dāng)運(yùn)行程序時(shí)，這些

樣品信息都會(huì)顯示）。因?yàn)檫@種估算是根據(jù)已知容量和熱力學(xué)的規(guī)律，

所以溫度比模塊或探針控制更加精確。運(yùn)行計(jì)算控制能縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)

間，簡(jiǎn)短的程序操作能保護(hù)酶的活性并減少引物的損失。

B）模塊控制（block）

模塊控制與計(jì)算控制精度相比較低。在模塊控制下，樣品溫度通

常是在模塊后才到達(dá)設(shè)置的溫度。這段延遲時(shí)間主要是因?yàn)楣茏拥念?/p>

型和樣品體積引起的。

C）探針控制（probe）

通常，探針控制可用于不同的環(huán)境中，但是它需要小心使用。探

針不能用于微型板和玻片。

市場(chǎng)上主要的品牌和產(chǎn)品AB：2720、9700、ProFlex、VeritiBio-Rad：MJMini、MyCycler、PTC200、PTC240、C1000、S1000Eppendorf：MastercyclerproS/pro/pro384熒光定量PCR熒光定量PCR：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，PCR反應(yīng)過程中，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。目的：獲得初始模板DNA的濃度。熒光定量PCR儀的關(guān)鍵是溫控和熒光激發(fā)、檢測(cè)系統(tǒng)！如何定量？Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的閾值所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。定量原理

確定初始模板的濃度初始DNA量越多,熒光達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量熒光定量PCR兩種GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA1、染料法SYBRGreen1染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光2、探針法衡量熒光定量PCR儀的參數(shù)（招標(biāo)）

（以AB7500為例）1工作條件：220V電壓，10A電源。相對(duì)濕度<80%。熱功率<2600W

2技術(shù)規(guī)格2.1熱循環(huán)系統(tǒng)2.1.1 加熱冷卻方式:半導(dǎo)體2.1.2 升降溫速率:3.5℃/秒以上*2.1.3溫度范圍:4℃-99.9℃*2.1.4控溫精確度:±0.25℃2.2樣品系統(tǒng)2.2.1 樣品通量:單管、8聯(lián)管、96孔板，并無需適配器2.2.2 反應(yīng)體積:10-100ul2.2.3 運(yùn)行時(shí)間:<2小時(shí)2.2.4 機(jī)械設(shè)計(jì):樣品無需移動(dòng)2.2.5反應(yīng)后保存:可降溫至4℃保存2.3熒光系統(tǒng)2.3.1 熒光染料：FAMTM/SYBRGreenI,VIC/JOETM,NEDTM/TAMRATM/Cy3,ROXTM/TexasRed,Cy52.3.2 熒光校正：軟件支持Rox熒光校正去除誤差2.4光學(xué)系統(tǒng)2.4.1 激發(fā)光源：鹵鎢燈，配備時(shí)間監(jiān)測(cè)及自我診斷程序2.4.2 濾光系統(tǒng)：五色光源濾光片結(jié)合熒光濾光片（630nm-650nm，570nm-590nm，540nm-550nm，510nm-530nm，455nm-485nm）2.4.3 檢測(cè)系統(tǒng)：CCD攝像機(jī)一次成像2.4.4 檢測(cè)方式：實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)，動(dòng)態(tài)顯示，可同時(shí)檢測(cè)5種熒光染料，必須有520nm，550nm，580nm，610nm，650nm這五塊濾光片*2.4.5實(shí)驗(yàn)要求：必須能同時(shí)檢測(cè)FAM、VIC、TAMRA、ROX四種熒光，能進(jìn)行探針法定量，開展CNV研究2.5 檢測(cè)性能2.5.1檢測(cè)靈敏度：能檢測(cè)到≤10個(gè)拷貝數(shù)的模板，置信度99.7%2.5.2線性范圍：109以上2.5.3檢測(cè)分辨率：99.7%置信度下能有效分辨5000和10000模板拷貝數(shù)的差異2.6分析功能2.6.1定量量型：能進(jìn)行絕對(duì)定量和相對(duì)定量,可同時(shí)對(duì)無限個(gè)數(shù)據(jù)同時(shí)進(jìn)行分析，比對(duì)和作柱形圖2.6.3分析應(yīng)用：可以進(jìn)行熔解曲線分析、突變分析、等位基因分析等2.7軟件系統(tǒng)

2.7.1 定量PCR軟件：有絕對(duì)定量和相對(duì)定量軟件*2.7.2PrimerExpress軟件：有，含正版引物與探針設(shè)計(jì)軟件，可進(jìn)行TaqmanMGB探針的設(shè)計(jì)及合成2.7.3 熒光校正軟件：有*2.7.4拷貝數(shù)分析軟件：有，含CopyCaller分析軟件2.7.5 獨(dú)立相對(duì)定量軟件：有，可同時(shí)對(duì)無限個(gè)數(shù)據(jù)同時(shí)進(jìn)行分析*2.7.6SNP分析軟件：有，含AutoCaller分析軟件2.8試劑盒2.8.1 安裝試劑盒：有2.8.2 基本試劑盒：原廠家可提供完備的基本試劑盒供選擇2.8.3 SNP試劑盒：可提供原廠家500萬種SNP檢測(cè)試劑盒

2.8.4 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試劑盒：原廠家可提供國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試劑盒2.8.5 拷貝數(shù)試劑盒：可提供原廠家160萬種SNP檢測(cè)試劑盒并有配套分析模塊2.8.6 藥物代謝酶分型試劑盒：原廠家可提供藥物代謝酶SNP分型試劑盒2.8.7MicroRNA分析試劑盒：原廠家可提供包含有針對(duì)人、小鼠、大鼠、擬南芥、果蠅和線蟲的MicroRNA分析產(chǎn)品。2.8.8 基因表達(dá)試劑盒：可提供原廠家100萬種基因表達(dá)檢測(cè)試劑盒*2.9 試劑、耗材：開放式2.10 裝機(jī)指標(biāo)：99.7%的置信度下分辨5000和10000模板拷貝數(shù)的差異3基本配置和附件3.1商用主流計(jì)算機(jī)及UPS3.2安裝試劑盒和純熒光校正板3.3RNASEP校驗(yàn)板3.4SDS系統(tǒng)操作軟件3.5PrimerExpress3.0引物和探針設(shè)計(jì)軟件

4選件：無

5資格證明：有ISO9001質(zhì)量認(rèn)證，符合CE認(rèn)證，有醫(yī)療器械注冊(cè)證

6技術(shù)服務(wù)

6.1安裝、調(diào)試：需要原生產(chǎn)廠家現(xiàn)場(chǎng)安裝調(diào)試6.2培訓(xùn)：需要原生產(chǎn)廠家進(jìn)行安裝培訓(xùn)和售后培訓(xùn)6.3技術(shù)資料：全套安裝、操作和維護(hù)使用說明書，軟件免費(fèi)更新

7質(zhì)量保修期7.1保修期：自驗(yàn)收合格日起整機(jī)（包括配件）一年全保，終身維護(hù)

7.2保修點(diǎn)：國(guó)內(nèi)至少三個(gè)保修點(diǎn)可提供部件更換，原廠專業(yè)維修

*8其他要求：近5年內(nèi)浙江省定量PCR（須為96孔板標(biāo)準(zhǔn)型配置），用戶不少于100個(gè)，提供詳細(xì)清單。市場(chǎng)上主要的品牌和產(chǎn)品ABI：7000、7300、7500、7700、7900HT、StepOnePlus、StepOne、PRISMStepOne；2015年新發(fā)產(chǎn)品：7300Plus??！BIO-RAD：CFX96、iQ5、MyiQ、DNAEngineOpticon2、Chromo4、MiniOpticon；Stratagene：MX3000P、MX3005P；Roche：LightCycler

480、LightCycler2.0、LightCyclerNano；Eppendorf：Masercycler；數(shù)字PCR數(shù)字PCR即DigitalPCR（dPCR)，是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。相較于熒光定量PCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量。應(yīng)用：1、絕對(duì)定量2、稀有突變檢測(cè)（傳染病研究如HIV）3、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)4、環(huán)境樣本檢測(cè)5、單細(xì)胞基因表達(dá)6、病毒載量鑒定數(shù)字