PCR的種類及應(yīng)用

PCR的種類及應(yīng)用

序2023/2/41

PCR的歷史操作過程引物步驟

PCR的各種變體PCR的應(yīng)用鑒定基因親子鑒定診斷遺傳病克隆基因誘變分析遠(yuǎn)古DNA鑒定特定表型的突變體基因比較基因表達(dá)量

目錄2023/2/43PCR這項(xiàng)技術(shù)是由凱利·穆利斯(KaryMullis)發(fā)明，并因此在七年之后，1993年10月，獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)該項(xiàng)殊榮。穆利斯的想法是，利用一種人工方法，和反復(fù)相同程序的方法，并利用一種特殊的酶——即DNA聚合酶來擴(kuò)增特定的DNA片段。PCR歷史2023/2/4DNA的復(fù)制DNA在復(fù)制時(shí)，雙鏈DNA解旋成兩股分別進(jìn)行。其復(fù)制過程的復(fù)制起點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式，故稱復(fù)制叉。以復(fù)制叉向前移動(dòng)的方向?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，一條模板鏈為3’—〉5’走向，在其上DNA能以5’—〉3’方向連續(xù)合成，稱為前導(dǎo)鏈(leadingstrand)；另一條模板鏈為5’—〉3’走向，在其上DNA也是5’—〉3’方向合成，但與復(fù)制叉移動(dòng)的方向正好相反，故隨著復(fù)制叉的移動(dòng)形成許多不連續(xù)的岡崎片段，最后在連成一條完整的DNA鏈，該鏈稱為后隨鏈(laggingstrand)。2023/2/45

①5’→3’的聚合作用：不是復(fù)制染色體而是修補(bǔ)DNA，填補(bǔ)DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3’→5’的外切酶活性：消除在聚合作用中摻入的錯(cuò)誤核苷酸。③5’→3’外切酶活性：切除受損傷的DNA，可用于切口平移（nicktranslation).

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一個(gè)片段，只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，失去了5’→3外切酶活性。它可用于填補(bǔ)DNA單鏈末端成為雙鏈。DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶是從一種水生棲熱菌(Thermusaquaticus)yT1株分離提取的.yT是一種嗜熱真菌，能在70-75℃生長.存在于水生嗜熱菌(Thermusaquaticus)的嗜熱DNA聚合酶，可在74℃復(fù)制DNA，在95℃仍具有酶活力。該酶可在離體條件下，以DNA為模板，延伸引物，合成雙鏈DNA。這個(gè)酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。該酶基因全長2496個(gè)堿基，編碼832個(gè)氨基酸，酶蛋白分子為94KDa.其比活性為200000單位/mg.75～80℃時(shí)每個(gè)酶分子每秒鐘可延伸約150個(gè)核苷酸，70℃延伸率大于60個(gè)核苷酸/秒，55℃時(shí)為24個(gè)核苷酸/秒.溫度過高(90℃以上)或過低(22℃)都可影響TaqDNA聚合酶的活性，該酶雖然在90℃以上幾乎無DNA合成，但確有良好的熱穩(wěn)定性，在PCR循環(huán)的高溫條件下仍能保持較高的活性.TaqDNA聚合酶2023/2/47PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增。它可以在試管里建立反應(yīng)，經(jīng)過數(shù)小時(shí)之后，就能將極微量的目的基因或者某一特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)十萬倍，乃至千百萬倍，而無需通過繁瑣費(fèi)時(shí)的基因克隆程序，便可獲得足夠數(shù)量的精確的DNA拷貝，所以有人亦稱為無細(xì)胞的分子克隆法。PCR的定義PCR操作過程1、預(yù)變性（Initialdenaturation）．模板DNA完全變性對PCR能否成功至關(guān)重要，一般95℃加熱3-5分鐘。2、引物退火（Primerannealing）退火溫度一般需要憑實(shí)驗(yàn)（經(jīng)驗(yàn)）決定。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。3、引物延伸引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長短而定。4、循環(huán)中的變性步驟循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性：變性時(shí)間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。5、循環(huán)數(shù)大多數(shù)PCR含25-35循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特?zé)鯒l帶6、最后延伸在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)引物可以采取以下原則：GC所占比例為40％－60％兩個(gè)引物的Tm，相差小于5℃，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm與引物的相差不超過10℃。黏合溫度通常比計(jì)算的最低Tm低5℃，但是要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)為不同條件下的PCR選擇不同的黏合溫度。內(nèi)部的具有自身互補(bǔ)性的發(fā)卡結(jié)構(gòu)不超過4個(gè)，其二聚體中不超過8個(gè)。3‘末端尤其重要，必須不含有與其他引物互補(bǔ)的序列，并且要與模板完全互補(bǔ)。倒數(shù)第二個(gè)最好是G/CPCR的各種變體反向PCR(InversePCR,IPCR)不對稱PCR(asymmetricPCR)多重PCR熒光定量PCR（Q-PCR)反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription,RT-PCR)

巢式PCR(NESTPCR)遞減PCR(TouchdownPCR)2023/2/410原理：擴(kuò)增引物相反方向DNA

序列的技術(shù)。用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對該段DNA進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對反向的引物進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進(jìn)行分析研究.

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已知序列未知序列反向PCR(InversePCR,IPCR)1.用一種在靶序列上沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化大分子量的DNA

2.產(chǎn)生的大小不同的線性DNA片段群體，其中具靶DNA區(qū)段的DNA分子長度不超過2-3Kb,經(jīng)連接后環(huán)化成環(huán)狀分子3.按靶序列設(shè)計(jì)的一對向外引物同靶序列5，--端互補(bǔ)序列退火結(jié)合，其延伸方向如圖中箭頭所指4.經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的主要是線性雙鏈DNA分子，它是由左側(cè)的序列和右側(cè)序列首位連接而成，其接點(diǎn)就是限制酶的識別位點(diǎn)2023/2/412應(yīng)用：

利用反向PCR可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析，探索鄰接已知DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長cDNA進(jìn)行分子克隆，建立全長的DNA探針。

應(yīng)用于染色體步移、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點(diǎn)分析等研究。局限性：

需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。2023/2/413

就像任何DNA一樣，PCR的雙鏈DNA產(chǎn)物也可以供序列測定使用。然而，按照Sanger雙脫氧末端鏈終止法測定DNA的核苷酸序列，最好是使用單鏈模版DNA?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出了一種專門用于制備單鏈DNA的技術(shù)—不對稱PCR技術(shù)。

這種技術(shù)，除了使用的兩種引物濃度相差100倍以外，其他的方面跟常規(guī)PCR技術(shù)沒有什么本質(zhì)的區(qū)別。

不對稱PCR

2023/2/414基本原理：

PCR擴(kuò)增所用的兩條引物中，濃度受限制的只及高濃度的1%（或2%）。經(jīng)過PCR循環(huán)直到限制引物耗盡之前，擴(kuò)增的引物是雙鏈的DNA序列。而后，反應(yīng)混合物中的另一種高濃度的引物，則利用限制引物合成的DNA鏈做模板，繼續(xù)引導(dǎo)DNA合成。這樣模板鏈繼續(xù)再循環(huán)，由高濃度的引物合成的DNA要比限制引物多得多，而且仍保持單鏈狀態(tài)。2023/2/415不對稱PCR的原理多重PCR

一般PCR僅應(yīng)用一對引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定.多重PCR(multiplexPCR)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同

多重PCR的試驗(yàn)步驟

同一般的PCR操作相同，只是反應(yīng)中所加入的是多對引物而不是一對引物。

1.DNA提?。篋NA提取可以用DNA提取試劑盒或?qū)嶒?yàn)室常用的一些DNA提取方法進(jìn)行。

2.DNA定量：用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA含量測定。

3.多重PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系可以選定為20μl，50μl等，反應(yīng)體系中含有：DNA模板，Mg++，dNTP，TaqDNA聚合酶，各種引物等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，設(shè)計(jì)合適的循環(huán)參數(shù)。在設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)時(shí)要注意兩個(gè)原則：一是退火溫度要足夠高。這是因?yàn)?，多重PCR技術(shù)是在擴(kuò)增體系中加入了多對引物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，這樣就會(huì)由于錯(cuò)配而產(chǎn)生一些非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，增高退火溫度，可以有效的減少非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的生成；二是循環(huán)參數(shù)要盡量少，以利于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。多重PCR在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA段，其擴(kuò)增效率并不是完全相同的，循環(huán)參數(shù)的增加，會(huì)使Taq酶的消耗增加，再加上每對引物相對退火效率不同，就會(huì)使擴(kuò)增產(chǎn)物混亂，所以，循環(huán)次數(shù)不宜過多。

4.電泳檢測及結(jié)果分析：取擴(kuò)增產(chǎn)物10×與26×載樣緩沖液(溴酚藍(lán))混勻上樣，同時(shí)加入分子量標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mlE、恒壓(200-600V)、電泳1-2小時(shí)后，置凝膠于紫外檢測凝膠分析儀觀察結(jié)果，并拍照，記錄分析結(jié)果。

多重PCR的主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測或鑒定和病原微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。1）多種病原微生物的同時(shí)檢測或鑒定，是在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增.

2）某些病原微生物，某些遺傳病或癌基因，型別較多，或突變或缺失存在多個(gè)好發(fā)部位，多重PCR可提高其檢出率并同時(shí)鑒定其型別及突變等可系統(tǒng)應(yīng)用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳頭瘤病毒的分型;單純皰疹病毒的分型;杜氏肌營養(yǎng)不良癥的分型及癌基因的檢測等.

應(yīng)用熒光定量PCR(Q-PCR)

Q-PCR：是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析

將模板稀釋成一系列的濃度梯度進(jìn)行PCR反應(yīng)，用個(gè)這個(gè)結(jié)果作標(biāo)準(zhǔn)曲線，模板可以用已知濃度的樣品或未知濃度的樣品。用模版初始量的log值對每個(gè)稀釋樣品的Ct值作圖，兩者稱遞減的線性關(guān)系，稱之為標(biāo)準(zhǔn)曲線。作標(biāo)準(zhǔn)曲線用來評定反應(yīng)條件的優(yōu)化（保證樣本有準(zhǔn)確可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果）

Q-PCR

熒光化學(xué)方法1）DNA結(jié)合燃料（SYBRGreen1）SYBRGreen1是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合燃料，與dsDNA非特異性結(jié)合。在游離的狀態(tài)下，SYBRGreen1發(fā)出微弱的熒光，但一旦與dsDNA結(jié)合，熒光強(qiáng)度增加1000倍。

缺乏特異性；不能用于多重反應(yīng)，因?yàn)椴荒軈^(qū)分不同擴(kuò)增子發(fā)出的熒光，用于單重實(shí)驗(yàn)。2）熒光燃料標(biāo)記的序列特異性寡核苷酸引物或探針（TaqMan和分子信標(biāo)）TaqMan實(shí)驗(yàn)主要優(yōu)點(diǎn)：高特異性、高信噪比和能進(jìn)行多重反應(yīng)。

缺點(diǎn)：探針的初始成本比較高和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)比較繁瑣。

熒光報(bào)告基團(tuán)的種類：FAM(發(fā)綠色熒光)、HEX、TAMRA、Texas

Red和Cy5等

分子信標(biāo)（molecularbeacon）是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。Q-PCR的應(yīng)用（1）熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析，絕對定量和相對定量。生物學(xué)家通常對下列事情感興趣：a)給定的血樣中的病毒顆粒數(shù)；b)相當(dāng)量的腫瘤組織和正常組織比，p53mRNA改變了多少倍。（2）基因表達(dá)差異分析。

例如：與一個(gè)生物合成途徑有關(guān)的三個(gè)基因（A、B、C），選擇內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，在兩個(gè)樣本（a、b）中的相對表達(dá)情況。用TaqMan探針進(jìn)行多重實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增分析基因表達(dá)差異（3）基因型/等位基因分析，例如SNP檢測等（4）轉(zhuǎn)基因生物檢測，比如可以準(zhǔn)確的檢測食品中某一種轉(zhuǎn)基因成分的含量。其實(shí)就是跟野生型生物相比該基因表達(dá)量RT-PCR

RT-PCR有很高的敏感性，可以用來分析不同組織，或是相同組織不同發(fā)育階段中mRNA表達(dá)狀況的相關(guān)性。2023/2/424巢式PCR

巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片斷短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。一般應(yīng)用于動(dòng)物方面。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等巢式PCR，可以在106基因組背景下檢測到一個(gè)拷貝的病毒基因，所以特異性很好，但也是最容易污染的PCR。TouchdownPCR用來避免非特異性序列的擴(kuò)增PCR中引物的黏合溫度(annealingtemperature)決定了黏合的特異性，溫度越高特異性越強(qiáng)，但過高則不能實(shí)現(xiàn)引物和模板的結(jié)合，而過低會(huì)產(chǎn)生大量非特異性產(chǎn)物。因此進(jìn)行PCR時(shí)需要尋找合適的黏合溫度。遞減PCR開始先設(shè)定一個(gè)比較高的黏合溫度，每個(gè)循環(huán)黏合溫度下降1℃，到一個(gè)較低溫度以后每個(gè)循環(huán)的黏合溫度保持不變直到結(jié)束。在剛下降到特異性結(jié)合可以進(jìn)行的最高溫度時(shí)，可以達(dá)到最高的特異性。這樣在起初的幾個(gè)循環(huán)中，特異性擴(kuò)增序列可