碩士研究生(眼科學(xué))開題報(bào)告

學(xué)院：第二臨床醫(yī)學(xué)院點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本

自噬相關(guān)蛋白p62及LC3在大鼠急性高眼壓模型視網(wǎng)膜中的表達(dá)及意義研究生：鄭冰茹導(dǎo)師：吳瑜瑜教授立項(xiàng)依據(jù)目錄研究目的、意義主要內(nèi)容及創(chuàng)新點(diǎn)123458預(yù)期結(jié)果及可能的問題實(shí)驗(yàn)進(jìn)展安排6預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果立項(xiàng)依據(jù)

青光眼是一組以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinalganglioncells，RGCs)及其軸突數(shù)目進(jìn)行性丟失、視盤凹陷擴(kuò)大、視野缺失為特征，伴眼壓升高的致盲性眼病。立項(xiàng)依據(jù)青光眼視神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制立項(xiàng)依據(jù)青光眼視神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制氧化應(yīng)激反應(yīng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子剝奪谷氨酸興奮毒性反應(yīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活免疫調(diào)控紊亂視神經(jīng)軸突的保護(hù)視盤重塑RGCs的保護(hù)立項(xiàng)依據(jù)免疫調(diào)控自噬在青光眼視神經(jīng)病變發(fā)病機(jī)制中的作用自噬Autophagy立項(xiàng)依據(jù)

自噬（Autophagy）即真核生物通過(guò)溶酶體機(jī)制降解細(xì)胞內(nèi)組分的過(guò)程。細(xì)胞通過(guò)自噬降解胞內(nèi)細(xì)胞器、微生物、可溶性蛋白及RNA以維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝原料。立項(xiàng)依據(jù)自噬的過(guò)程立項(xiàng)依據(jù)自噬體標(biāo)記蛋白LC3

定義：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associatedprotein1lightchain3，LC3/Atg8)是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白。

分類：①LC3-I蛋白：散在分布在胞漿內(nèi)

②LC3-II蛋白：定位于自噬體的內(nèi)膜和外膜

檢測(cè)意義：①LC3-II的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量

②自噬時(shí)表現(xiàn)為L(zhǎng)C3-I的減少和LC3-II的增加，通過(guò)LC3-II/LC3-I或者LC3-II/(LC3-I+LC3-II)即可反映自噬水平立項(xiàng)依據(jù)自噬過(guò)程的調(diào)控[1]MónikaL,PéterL,Theroleoftheselectiveadaptorp62andUbiquitin-LikeproteinsinAutophagy立項(xiàng)依據(jù)自噬相關(guān)蛋白p62

功能：在自噬降解泛素化蛋白、錯(cuò)誤折疊及異常積累的蛋白和功能失調(diào)的細(xì)胞器的過(guò)程中起調(diào)控作用作用機(jī)制：通過(guò)LC3相互作用區(qū)（LC3interactingregion，LIR）與自噬體膜的Atg8/LC3結(jié)合，從而介導(dǎo)自噬途徑對(duì)異常積累蛋白及細(xì)胞器的識(shí)別及降解。

檢測(cè)意義：①自噬流發(fā)生時(shí)p62水平下降②自噬體形成過(guò)多，或自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶

體的過(guò)程發(fā)生障礙時(shí)則p62水平增高立項(xiàng)依據(jù)p62在凋亡、細(xì)胞存活中的作用立項(xiàng)依據(jù)KjtaokaY[3]等人研究發(fā)現(xiàn)眼壓穩(wěn)定升高時(shí)，視神經(jīng)中p62及LC3-II水平增高，提示自噬流的聚集參與其中；另外，該研究發(fā)現(xiàn)煙酰胺單核苷酸磷酸轉(zhuǎn)移酶3(nicotinamidemononucleotideadenvlYltransferase，NMNAT)表達(dá)升高，Nmnat能維持軸突蛋白的穩(wěn)定性和調(diào)制軸突內(nèi)囊泡運(yùn)輸，對(duì)軸突發(fā)揮保護(hù)作用。抑制細(xì)胞內(nèi)p62水平，促進(jìn)LC3-II表達(dá)，誘導(dǎo)自噬并保護(hù)軸突。

PaulS[4]等人發(fā)現(xiàn)自噬調(diào)節(jié)蛋白p62可降解BCLl0，調(diào)控NFKBl一RELA通路，抑制T細(xì)胞分化。[3]KjtaokaY,MunemasaY,KojimaK,eta1．AxonalprotectionbyNmnat3overexpressionwithinvolvementofautophagyinopticnervedegeneration[J]CellDeathDis，2013，4：e860.[4]PaulS，SchaeferBC．SelectiveautophagyregulatesTcellactivation[J].

Autophagy，2012，8(11)：1690—1692．p62在青光眼視神經(jīng)病變中的作用立項(xiàng)依據(jù)p62在青光眼視神經(jīng)病變中的作用p62免疫調(diào)控清除作用凋亡途徑軸突保護(hù)研究目的及意義研究目的檢測(cè)大鼠急性高眼壓模型中RGCs凋亡率并觀察其形態(tài)變化

檢測(cè)p62、LC3蛋白在大鼠急性高眼壓模型視網(wǎng)膜中的表達(dá)情況

探討p62在大鼠急性高眼壓模型視網(wǎng)膜中的作用及機(jī)制探討自噬過(guò)程與大鼠急性高眼壓模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的聯(lián)系研究目的及意義研究意義利用自噬清除細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器、降解大分子蛋白質(zhì)及維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的功能，提高視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的耐受力

通過(guò)研究自噬調(diào)節(jié)過(guò)程，探討其可能作用機(jī)制，為青光眼視神經(jīng)保護(hù)提供新的思路研究主要內(nèi)容構(gòu)建大鼠急性高眼壓模型（0.9%的生理鹽水灌注法）按時(shí)間段分組，獲取視網(wǎng)膜組織及蛋白，進(jìn)行關(guān)于p62、LC3的Western蛋白印跡檢測(cè)，免疫組化，定性定量分析表達(dá)水平檢測(cè)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡情況檢測(cè)p62、LC3在視網(wǎng)膜各層的表達(dá)情況檢測(cè)p62、LC3蛋白的表達(dá)量獲取數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（擬用spss17.0進(jìn)行分析，選取檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05）研究主要內(nèi)容大鼠110cm(約88mmHg)25G（0.55*20mm）的輸液針頭0.9%生理鹽水以瓶?jī)?nèi)的液體不再向眼內(nèi)滴注、虹膜蒼白和視網(wǎng)膜蒼白水腫等作為動(dòng)物眼達(dá)到外界給定壓強(qiáng)的判斷依據(jù)，維持高眼壓狀態(tài)60min優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，研究時(shí)程短，結(jié)果具有較好的可重復(fù)性。點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本成年雌性SD大鼠55只正常對(duì)照組急性高眼壓組建模24h48h12h1h0h免疫組化Western-blot細(xì)胞免疫熒光HE染色TUNEL法p62、LC3蛋白在視網(wǎng)膜的定性及定位情況計(jì)算RGCs的數(shù)量；檢測(cè)RGCs的凋亡率p62、LC3蛋白在視網(wǎng)膜的定量檢測(cè)

技術(shù)路線圖主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)

思路創(chuàng)新：以往關(guān)于青光眼視神經(jīng)病變的研究主要集中在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路，而本實(shí)驗(yàn)從新的角度——自噬探討其在大鼠急性高眼壓模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：自噬是一個(gè)隨時(shí)間不斷變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)五個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分組；并分別從形態(tài)學(xué)，蛋白質(zhì)水平出發(fā)，更全面分析自噬過(guò)程與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間的關(guān)聯(lián)預(yù)期結(jié)果

HE染色：正常對(duì)照組可見視網(wǎng)膜各層分布整齊結(jié)構(gòu)清晰，高眼壓組初期視網(wǎng)膜呈水腫狀態(tài)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各層呈萎縮狀態(tài)；TUNEL法：高眼壓組凋亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加；免疫組化：高眼壓組p62、LC3蛋白在視網(wǎng)膜多層中均有表達(dá)；Westernblot：高眼壓組p62蛋白的表達(dá)隨著時(shí)間先減少，隨后增加；LC3蛋白的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)先增加，隨后減少問題及解決方案實(shí)驗(yàn)過(guò)程問題解決方案造模過(guò)程麻醉不足，動(dòng)物提前蘇醒；麻醉過(guò)深，動(dòng)物致死嚴(yán)格按量麻醉，正確腹腔注射，縮短操作時(shí)間取材過(guò)程眼球標(biāo)本的保存提前準(zhǔn)備液氮用以冰凍保存，4%多聚甲醛固定檢測(cè)過(guò)程檢測(cè)機(jī)器誤差人為造成誤差盡可能在同一臺(tái)儀器測(cè)量，并多次重復(fù)測(cè)量預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常0h1h48h12h24hLC3-ILC3-IIΒ-actin實(shí)驗(yàn)進(jìn)展安排201