細(xì)菌漆酶LacA在大腸桿菌中的異源表達(dá)

細(xì)菌漆酶LacA在大腸桿菌中的異源表達(dá)組員（按學(xué)號排序如下）：劉艷紅、王瑞、姚偉靜、張明珠、康興、程飛、孫元元、劉燕紅、程旭、査倩、潘偉民、傅聲祥匯報人：程飛實(shí)驗簡介實(shí)驗原理實(shí)驗?zāi)康膶?shí)驗材料實(shí)驗過程一、實(shí)驗簡介漆酶（Laccase）是一種含酮的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類和非酚類化合物發(fā)生氧化，同時伴隨由分子氧還原成水。漆酶一般由500-600個氨基酸組成，不同來源的漆酶氨基酸序列的相似程度較低，但是其催化位點(diǎn)序列相當(dāng)保守。對漆酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其分子具有3個銅離子結(jié)合位點(diǎn)，共結(jié)合四個銅離子。野生漆酶的產(chǎn)量低，重組表達(dá)是提高漆酶產(chǎn)量的一種常用方法。本實(shí)施主要通過由保守區(qū)設(shè)計簡并引物擴(kuò)增部分漆酶LacA片段，以及反向PCR擴(kuò)增已知序列臨近的未知序列，并且通過序列拼接獲得完整的LacA基因序列，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行異源高效表達(dá)。二、實(shí)驗?zāi)康墨@得細(xì)菌LacA基因。LacA在大腸桿菌中異源表達(dá)。三、實(shí)驗原理DNA重組。簡并引物。酶。TA克?。簩?′端具有單個“A”突出末端的PCR產(chǎn)物克隆到3′端具有單個“T”突出末端的載體的克隆法。反向PCR:反向PCR是一種新型的基因擴(kuò)增方法，它能擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA。載體選擇。藍(lán)白篩選：

質(zhì)粒載體含有大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因（lacz）的啟動子（受IPTG誘導(dǎo)）及其編碼α肽鏈（β-半乳糖苷酶的氨基末端短片段）的DNA序列（特稱為lacz基因）。受體大腸桿菌細(xì)胞的β-半乳糖苷酶發(fā)生了突變，失去的氨基末端。當(dāng)lacz基因編碼的α肽鏈同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)時，便會產(chǎn)生出有活性的β-半乳糖苷酶分子，在IPTG誘導(dǎo)下，會啟動表達(dá)，分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色背景。當(dāng)MCS中插入外源基因后，會阻斷α肽鏈合成，不能形成互補(bǔ)，不能產(chǎn)生功能活性的β-半乳糖苷酶，也就不會產(chǎn)生藍(lán)色背景。所以含有重組質(zhì)粒載體的克隆是白色的。四、實(shí)驗材料1.實(shí)驗儀器（1）超微量分光光度計。（2）制冰機(jī)。（3）高壓滅菌器。（4）PCR儀。（5）電子天平。（6）磁力攪拌器。（7）電泳儀。（8）冷凍離心機(jī)。（9）高速離心機(jī)。（10）凝膠成像系統(tǒng)。（11）冷凍研磨儀。（12）超凈工作臺。（13）烘箱。（14）液氮罐。（15）pH劑。2.實(shí)驗試劑(1)載體：質(zhì)粒pMD18-T，質(zhì)粒pET-28a（+）。(2)產(chǎn)漆酶LacA細(xì)菌。(實(shí)驗室自備)。(3)限制性內(nèi)切酶：BamHI，SalⅠ。(4)T4DNA連接酶；TaqDNA聚合酶。(5)0.1mol/LCaCl2溶液。(6)LB瓊脂固體平板（含Kana）。(7)LB液體培養(yǎng)基。(8)20mg/mLX-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）。(9)200mg/mLIPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)。(10)瓊脂糖。(11)無菌雙蒸水。(12)JM109感受態(tài)細(xì)胞。(13)卡那霉素50mg/L。(14)液氮。(15)合成引物。(16)PARAFILM。(17)Tubes。(18)溴化乙錠。(19)Agarose。(20)Sodiumchloride。(21)TRYPTONE。(22)YEASTEXTRACT。(23)TE緩沖液T10E1。(24)甘油。(25)CutSmartBuffer。(26)ABTS。(27)上樣緩沖液。(28)T4DNALigaseBuffer。(29)Trans2KplusDNAMarker。(30)2XPowerTaqPCRMaster。(31)酚/氯仿/異戊醇。(32)高純質(zhì)粒小量制備試劑盒100次。(33)普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（離心柱形）。(34)乙醇。(35)裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）。(36)Tris-飽和酚、氯仿。五、實(shí)驗步驟（一）、依據(jù)蛋白質(zhì)保守區(qū)設(shè)計引物（二）、PCR擴(kuò)增保守區(qū)之間的基因序列（三）、反向PCR獲得全長基因（四）、構(gòu)建重組表達(dá)載體（五）、異源表達(dá)以及蛋白活性檢測1.引物設(shè)計原則2.上游引物與下游引物1.堿裂解法提取細(xì)菌基因組DNA2.PCR擴(kuò)增保守區(qū)之間的序列3.膠回收以及純化DNA4.目的片段與載體連接以及目的片段測序測序。1.反向PCR引物設(shè)計2.細(xì)菌基因組酶切3.自身環(huán)化連接4.反向PCR5.測序以及序列拼接獲全長基因1.細(xì)菌基因組DNA提取以及引物設(shè)計2.表達(dá)載體選擇3.獲得LacA基因并與載體連接4.陽性重組子篩選1.異源表達(dá)2.LacA蛋白分離純化3.LacA活性檢測（一）依據(jù)蛋白質(zhì)保守區(qū)設(shè)計簡并引物1.依據(jù)蛋白質(zhì)保守區(qū)設(shè)計簡并引物2.上游引物以及下游引物1.依據(jù)蛋白質(zhì)保守區(qū)設(shè)計簡并引物引物設(shè)計原則：盡量降低簡并度；起始密碼子ATG，終止密碼子TAA,TAG,TGA不使用。密碼子偏好性；大腸桿菌中的稀有密碼子；2.上游引物PFHWHGIRL(取兩個堿基即可）CATTGGCATGGTATTCGTCTCACCACGGCATCCGCCTGGAATACGACTGGGATGCGGCTAGATTAGGTTCAYTGGCAYGGNATHMGNYTM代表AorCY代表CorTH代表AorCorTD代表AorGorTN代表GorAorTorC紅色代表不可用

FR:CAYTGGCAYGGNATHMGNYT簡并度：576/4用次黃嘌呤代替N（因為次黃嘌呤能很好的和4種堿基配對）降低簡并度。53下游引物PR35R代表AorG

FR:TGRTCNGTNACRTGRCARTG簡并度：256（二）PCR擴(kuò)增保守區(qū)之間的基因序列2.PCR獲取保守區(qū)之間的序列。1.提取細(xì)菌基因組DNA，利用SDS法。3.膠回收以及膠回收純化試劑盒純化DNA4.目的片段與載體連接以及目的片段測序測序。1.SDS法提取細(xì)菌基因組DNA1.5ml菌液4℃12000rpm離心30sec加入400μl裂解液，用移液槍槍頭反復(fù)抽吸輔助裂解，37℃水浴30min加入Xμl的5MNaCl溶液，顛倒試管，充分混勻后，13000rpm離心15min,取上清。純化DNA,等體積苯酚/氯仿/異戊醇沉淀DNA,1/10體積3mol/lNaAc，2,5倍體積預(yù)冷無水乙醇70%乙醇沉淀50ulTE含20ug/mlRase-20℃?zhèn)溆?.PCR獲取保守區(qū)之間的序列細(xì)菌基因組200ng10XTaqBuffer（Mg2+）5uldNTPs200μmol/LFPRPTaqDNA聚合酶0.5-1.5mMddH20TOTAL50ul94℃94℃55℃72℃依據(jù)聚合酶聚合速度cycles4min40s35s100s30sTaqDNA聚合酶能產(chǎn)生3’A的尾巴，因此PCR產(chǎn)物可以用于TA克隆首次使用PCR之前，要仔細(xì)閱讀說明書。除特別指出外，加入反應(yīng)成分的每一步都需在冰上操作。加入TaqDNA聚合酶后，都要混勻體系，并且用離心機(jī)輕甩一次。3.膠回收以及純化DNA配置含1%agarase的凝膠將PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣至膠孔里，添加Loadingbuffer，并點(diǎn)上markerPCR試劑盒回收目的片段測出DNA濃度。注意A260/A280（不小于1.8）以及A260/A230的值（不小于2.0）DNA樣品添加上樣緩沖液，其中含有甘油或者蔗糖，幫助DNA沉入膠的底部，其中還有溴酚藍(lán)或者二甲苯青，指示樣品遷移情況。5’端磷酸化純化：等量的苯酚/氯仿/異戊醇沉淀：1/10體積3mol/lNaAc，2,5倍體積預(yù)冷無水乙醇。TE溶解。回收DNA10Xbutter10mmol/LATPT4多核苷酸激酶20UPCR產(chǎn)物回收:a.熔化：3倍體積bufferDE-A，75℃，溫浴。b.結(jié)合：混合液加入DNA制備管12000rpm，1min。3.洗滌：加500μlbufferW1.加700μLbufferW2.重復(fù)一次。3.洗脫：75℃無菌水洗脫，12000rpm，1min，收集，測濃度。T克隆載體1.載體用EcoRV產(chǎn)生突出的T2.經(jīng)Taq聚合酶PCR產(chǎn)物3’段有突出的A。3.經(jīng)連接酶連接就能將基因片段和載體連接。4.目的片段與載體連接以及測序連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞設(shè)立對照回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上提取質(zhì)粒（試劑盒：高純質(zhì)量少量制備試劑盒（離心柱型）測濃度測序載體：外源基因（摩爾比）=1:2~1:10載體/外源片段=載體含量（ng）X插入片段的長度

插入片段所需量（ng）X載體長度連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。a:加10ul連接產(chǎn)物到含有50ulcompetentcell的1.5mlEP管中，冰上放置30min。b:將EP管放入42度水浴鍋中熱激45sc:重新放入冰中2min。d:加入1mLLB培養(yǎng)基，放到37度復(fù)蘇1h。e:將復(fù)蘇后的菌體離心收集，涂含有Kana抗生素的LB固體板。f:將板放到37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h后，對長出來的菌落做菌落PCR鑒定陽性克隆。19（三）反向PCR獲得全長基因1.反向PCR原理。2.PCR引物設(shè)計3.細(xì)菌基因組酶切4.自身環(huán)化連接5.長距離反向PCR6.測序以及序列拼接全長基因1.長距離反向PCR原理2.反向PCR引物設(shè)計（1）根據(jù)LacA的部分基因序列，設(shè)計兩個特異的反向PCR引物。（由于測序結(jié)果未知，所以此處無法給出具體的引物序列）（2）IPs（3）IPa

注意：IPs和Ipa3’方向是相互背離的。不同于常規(guī)的PCR。3.細(xì)菌基因組酶切酶切體系基因組2μgbuffer限制性內(nèi)切酶20U溫度37℃時間4hddH2Ototal100μl（1）選用4種限制性內(nèi)切酶（X1，X2，X3，X4。對基因組的DNA分別進(jìn)行單酶切，前提是保證這四種酶在LacA上沒有酶切位點(diǎn)。

方法：通過細(xì)菌基因組序列以及保守序列周圍的序列，根據(jù)一般漆酶基因的大小，確定這四種限制性內(nèi)切酶。（2）酶切產(chǎn)物純化（PCR產(chǎn)物純化試劑盒）。（3）測濃度。自身環(huán)化連接體系酶切后基因組DNA0.5μg10XT4Buffer100μlT4DNA連接酶300U溫度16℃時間16hddH2OTOTAL1000μl4.自身環(huán)化連接（1）自身連接產(chǎn)物純化（TIANquickMidiPurificationKit普通DNA產(chǎn)物純化收試劑盒同前面內(nèi)容）。（2）測濃度。5.反向PCR94℃94℃70℃cycles2min40S13min34s（1）配置含1%agarase的凝膠。（2）將PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣至膠孔里，添加Loadingbuffer，并點(diǎn)上marker，染料使用EB。（3）用刀片切取含有目的片段的瓊脂糖凝膠，試劑盒純化DNA。(4)DNA磷酸化處理。（5）測濃度。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上提取質(zhì)粒（試劑盒：高純質(zhì)量少量制備試劑盒（離心柱型）測濃度測序以及序列拼接。序列拼接采用DNASTAR軟件的SeqMan程序。由重疊部分即可拼接出完整的全長基因。6.測序以及序列拼接全長基因獲得的全長基因提交GeneBank（四）構(gòu)建重組表達(dá)載體1.細(xì)菌基因組DNA的提取以及引物設(shè)計。2.表達(dá)載體的選擇pET-28-a（+）。3.獲取LacA基因并與載體連接。1.細(xì)菌基因組DNA的提取以及引物設(shè)計（1）SDS法提取細(xì)菌基因組DNA（2）引物設(shè)計原則a、由已知的LacA基因序列設(shè)計引物。b、在引物5’端設(shè)計酶切位點(diǎn)，以及添加保護(hù)堿基。軟件使用Primer5。FPa5’CGGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3’含有BamHI酶切位點(diǎn)。FRa5’ACGCGTCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3’含有SalI酶切位點(diǎn)。

2.表達(dá)載體的選擇pET-28a（+）3.獲取LacA基因并與載體連接PCR獲得LacA基因序列細(xì)菌基因組200ng10XTaqBuffer（Mg2+）5uldNTPsFPaRPaTaqDNA聚合酶ddH20TOTAL50ul（1）PCR獲得LacA基因序列（2）雙酶切PCR產(chǎn)物，試劑盒純化，測濃度。（3）雙酶切載體，純化，測濃度。（4）LacA與載體連接。（5）轉(zhuǎn)化JM109。雙酶切PCR產(chǎn)物10xcutsmartbuffer2ulBamHI-HF0.5ulSalI-HF0.5ulPCRLacA1ngddH2OTOTAL20ul溫度與時間37℃4h雙酶切pET-28a10xcutsmartbuffer2ulBamHI-HF0.5ulSalI-HF0.5ulpET-28a1ngddH2OTOTAL20ul溫度與時間37℃4hLacA與載體連接10xT4Ligasebuffer2ulT4Ligase0.5ulpET-28a0.5ul酶切后LacA1ngddH2OTOTAL20ul溫度與時間16℃過夜4.陽性重組子篩選（1）重組子涂平板篩選重組子的培養(yǎng)基：Kana50ug/mg,x-gal是2%,每個平板取40uL涂布，IPTG是20%每個平板取7uL涂布。

特注：Kana添加是在倒平板溫度降到可以用手觸摸再添加。X-gal和IPTG在平板凝固之后涂布。

（2）設(shè)對照組。陽性對照與陰性對照。

（3）在Kana抗性的平板可以生長，陽性菌落產(chǎn)生的是白色菌落。（4）陽性重組子進(jìn)行菌落PCR鑒定。（5）液體擴(kuò)大培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，測序。

涂布添加X-gal，IPTG和Amp的平板（五）異源表達(dá)以及蛋白檢測挑選的白色菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測序。如果測序為LacA則保存菌種（1:5

=甘油：菌種保存于-70℃冰箱。）異源表達(dá)：液體培養(yǎng)。大量產(chǎn)生發(fā)酵液。1.異源表達(dá)2.LacA蛋白的分離純化（1）實(shí)驗材料準(zhǔn)備-LB培養(yǎng)工程菌并離心收集（2）預(yù)處理-清洗菌體并重懸（3）蛋白質(zhì)粗提-超聲破碎離心（4）蛋白質(zhì)