核酸分子雜交及芯片技術(shù)

臨床分子診斷學(xué)-技術(shù)篇7核酸分子雜交及芯片技術(shù)NucleicAcidHybridizationandDNAChipTechnology教學(xué)內(nèi)容核酸分子雜交的基本原理核酸探針核酸分子雜交技術(shù)方法DNA芯片技術(shù)1、變性（denaturation）

在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團(tuán)，雙鏈解鏈成為單鏈。無共價(jià)鍵斷裂。2、融解溫度（Tm值）：

在DNA熱變性時(shí)，其A260的升高達(dá)最大值一半時(shí)的溫度。影響Tm的因素：

（1）DNA堿基的組成

G-C含量越多Tm值越高

A-T含量越多Tm值越低（2）溶液的離子強(qiáng)度

低離子強(qiáng)度Tm值越低

高離子強(qiáng)度Tm值越高（3）pH值

pH值5-9Tm值變化不明顯

pH<4pH>11不利于氫鍵形成

（4）變性劑

干擾堿基堆積力和氫鍵的形成3、復(fù)性

變性DNA經(jīng)過一定處理通過堿基互補(bǔ)重新形成雙螺旋的過程。二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)通過隨機(jī)碰撞配對(duì)緩慢“拉鎖鏈”快

DNA濃度

DNA片段的大小

DNA片段復(fù)雜性

合適的復(fù)性溫度

適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度影響復(fù)性速度的因素:可逆性(非共價(jià)結(jié)合)序列特異性(堿基互補(bǔ)配對(duì))紫外吸收黏度沉降系數(shù)比旋度生物活性淬火退火掌握概念應(yīng)用：探針單鏈化核酸的變性與復(fù)性特點(diǎn)4、雜交

根據(jù)核酸變性和復(fù)性的原理，兩條來源不同，但具有互補(bǔ)序列的核酸，按堿基配對(duì)原則復(fù)性形成一個(gè)雜交體，這個(gè)過程即雜交，或稱分子雜交。分類

DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA高度特異的允許一定程度的錯(cuò)配嚴(yán)格度

教學(xué)內(nèi)容核酸分子雜交的基本原理

核酸探針核酸分子雜交技術(shù)方法DNA芯片技術(shù)一、概念

探針（probe）

指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用，并能被特殊方法所檢測(cè)的分子。

例如抗原-抗體、生物素-親和素等均可看成是探針與靶分子的相互作用。

核酸探針

指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異互補(bǔ)雜交，雜交后又能被特殊方法檢測(cè)的已知被標(biāo)記（同位素或非同位素標(biāo)記）的核苷酸鏈。靶分子：核酸（DNAorRNA）核酸探針:1.與靶核酸分子特異互補(bǔ)的核苷酸鏈。2.被標(biāo)記，能被特殊方法檢測(cè)。實(shí)質(zhì)：通過檢測(cè)探針上的標(biāo)志物來反應(yīng)靶分子的存在與否以及量的多少。二、分類

根據(jù)性質(zhì)和來源不同：

（1）基因組DNA探針

有內(nèi)含子，雜交效率低

（2）cDNA探針

無內(nèi)含子，適用于基因表達(dá)的檢測(cè)

（3）RNA探針

單鏈性，特異性高；不穩(wěn)定，易降解

（4）寡核苷酸探針

合成方便，靈敏度受長(zhǎng)度限制稍差二、分類

根據(jù)標(biāo)記方法不同：

（1）放射性探針

（2）非放射性探針

理想的核酸探針標(biāo)記物應(yīng)具備

①高度的敏感性

②標(biāo)記物與探針結(jié)合后，不影響雜交時(shí)堿基配對(duì)及探針分子的主要理化性質(zhì)；③檢測(cè)方法除有高靈敏性、高特異性、假陽性率低外，尚需考慮環(huán)境污染少，價(jià)格低；

④若用酶標(biāo)記，應(yīng)對(duì)酶的Km值影響不大，以保證標(biāo)記反應(yīng)的效率和標(biāo)記產(chǎn)物的比活性。三、標(biāo)記（一）標(biāo)記物

放射性同位素標(biāo)記物

非放射同位素標(biāo)記物

1.放射性

常用的有32P/35S/3H。

特點(diǎn)：

檢測(cè)的靈敏度和特異性高

射線對(duì)人體有傷害

放射性物質(zhì)需特殊的處理

半衰期短不宜存放使用

2.非放射性標(biāo)記物

常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、熒光素、酶。

特點(diǎn)：

敏感性不如同位素標(biāo)記

穩(wěn)定性高、檢測(cè)時(shí)間短

操作簡(jiǎn)便

不需特殊的防護(hù)設(shè)備

不存在放射性污染（二）標(biāo)記法

酶反應(yīng)法

將標(biāo)記物（放射或非放射）預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，然后通過酶促反應(yīng)將標(biāo)記的核苷酸分子滲入探針分子中。化學(xué)反應(yīng)法

利用標(biāo)記物(非放射為主)分子上的活性基團(tuán)與核酸分子上的基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而將標(biāo)記物結(jié)合到探針分子上。1、隨機(jī)引物法（randompriming）

利用DNA聚合酶來合成與模板互補(bǔ)的新的DNA鏈。

將6-8寡核苷酸片段與已變性的DNA單鏈或RNA模板退火，使該片段隨機(jī)互補(bǔ)結(jié)合在單鏈分子上，在大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段作用下，以同位素標(biāo)記的dNTP為原料，寡核苷酸為引物的3’-OH端開始沿5’至3’方向，合成一條與模板互補(bǔ)的新DNA鏈。隨機(jī)引物（6-8nt）：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。46=409648=65536DNA聚合酶ⅠKlenow片段：5’→3’DNA聚合酶活性弱3’→5’外切核酸酶活性無5’→3’外切核酸酶活性鏈替代，比活高隨機(jī)引物法（randompriming）

2、切口平移法

◆胰DNA酶I在DNA雙鏈上隨機(jī)切開若干切口，切口處形成3’-OH末端。

◆大腸桿菌DNA聚合酶I以切口處開始作用，以另一條DNA鏈為模板。

◆4種三磷酸脫氧核苷酸為原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修復(fù)加入標(biāo)記核苷酸同時(shí)進(jìn)行，切口平行推移。

生成的兩條鏈都被同位素均勻標(biāo)記。大腸桿菌DNA聚合酶I的活性種類？5’3’聚合酶活性3’

5’外切酶活性5’3’

外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶I

（1）5’3’聚合酶活性標(biāo)記（2）3’5’外切酶活性（3）5’3’外切酶活性切口平移

5’->3’外切酶活性使缺口平移5’->3’聚合酶活性上游鏈延伸而被標(biāo)記3.末端標(biāo)記法

末端標(biāo)記法是將標(biāo)記物導(dǎo)入線型DNA或RNA的5’端或3’端的一類標(biāo)記法。

5’端標(biāo)記法

3’端標(biāo)記法（1）5’端標(biāo)記法（T4多聚核苷酸激酶）

用堿性磷酸酶切除DNA雙鏈分子或RNA單鏈5’末端的磷酸基團(tuán)，使其成為5’-OH，然后在（γ-32P）ATP存在下，經(jīng)T4多聚核苷酸激酶催化，將γ位上的32P轉(zhuǎn)移到DNA或RNA分子的5’-OH末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5’端均帶32P標(biāo)記。T4多聚核苷酸激酶催化（2）3’端標(biāo)記法（大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段）

大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段有5’→3’DNA聚合酶和微弱的3’→5’外切酶活性，但無5’→3’外切酶活性。對(duì)殘缺3’末端可進(jìn)行標(biāo)記。

末端的性質(zhì)？教學(xué)內(nèi)容核酸分子雜交的基本原理

核酸探針

核酸分子雜交技術(shù)方法DNA芯片技術(shù)

核酸分子雜交↓

固相雜交液相雜交膜上印跡雜交核酸原位雜交核酸分子雜交的分類核酸分子雜交技術(shù)是一種信號(hào)放大技術(shù)。一、膜上印跡雜交

印跡技術(shù)：將凝膠中待測(cè)的核酸分子轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的方法。指將待測(cè)核酸序列結(jié)合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進(jìn)行雜交的過程。1．固相支持物的選擇常用的固相支持物：硝酸纖維膜（NC）尼龍膜

PVDF膜（聚二氟乙烯膜）2．印跡方法Methodsoftransfer虹吸印跡法（Capillary）真空轉(zhuǎn)移法（Vacuum）電轉(zhuǎn)移法（Electrophoretic）BlotDNAtomembrane

CapillaryBlotting(upward)

nospecialequipmentrequired!1975年E.SouthernSouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)DNA片段<1kb，1小時(shí)DNA片段>15kb，18小時(shí)Electrophoreticblotting不宜用硝酸纖維素膜一般2~3小時(shí)，最多6~8小時(shí)especiallygoodforsmallfragmentsresolvedbyPAGEVacuumblotting30~60分鐘moreefficientandquantitativethancapillarymustapplyvacuumevenlyandnottoostrongly3．印跡類型

Southern印跡雜交

Northern印跡雜交斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交菌落或噬菌斑雜交原位雜交提取DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤與DNA或RNA探針雜交放射自顯影Southernblottinghybridization預(yù)雜交Southern印跡雜交的應(yīng)用：

檢測(cè)靶分子為DNA,檢測(cè)靶分子是否含有目的基因。

可用于基因組基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切圖譜分析、基因突變分析、DNA指紋圖譜等。Northern印跡雜交

應(yīng)用DNA探針檢測(cè)特異mRNA的一種雜交技術(shù)，主要用于分析mRNA的轉(zhuǎn)錄或mRNA分子大小，其方法類似于Southern印跡雜交。

RNA極易被RNase降解RNA酶抑制劑0.1%DEPC處理水(焦碳酸二乙酯)Northernblottinghybridization檢測(cè)靶分子為RNA，單鏈，探針制備時(shí)需注意是否與靶分子配對(duì)。pancreaskidneyskeletalliverlungplacentabrainheartmuscleGEFmRNANouthernblottinghybridization優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、迅速（直接點(diǎn)樣）；可在同一張膜上進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)；應(yīng)用：同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,可以得到半定量的結(jié)果；核酸粗提樣品的檢測(cè)效果也較好。Dotandslotblottinghybridization將變性后的DNA或RNA直接點(diǎn)樣于膜上檢測(cè)的是基因組DNA還是mRNA?Colonyorphagehybridization

從重組DNA文庫中篩選陽性克隆核酸原位雜交（nucleicacidhybridizationinsitu）用標(biāo)記的已知核酸序列為探針，與細(xì)胞涂片或組織切片中核酸進(jìn)行雜交檢測(cè)的方法。每張標(biāo)本所用雜交液較少，20~100μl，為了避免雜交液蒸發(fā)后造成雜交液濃縮，需使用密閉的濕盒。在組織或細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行DNA或RNA精確定位和定量。核酸原位雜交的基本步驟1.細(xì)胞或組織的固定：載玻片2.組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)3.探針的選擇和標(biāo)記4.雜交5.雜交結(jié)果檢測(cè)探針與分裂中期染色體DNA雜交，研究特定核酸序列在染色體中的精確定位；探針與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交，觀察該組織細(xì)胞中特定基因的表達(dá)水平；用特異性的細(xì)菌、病毒的核酸作為探針對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行雜交，確定有無該病原體的感染。應(yīng)用：FISH(熒光原位雜交)結(jié)果地高辛標(biāo)記的探針用抗地高辛-羅丹明顯示(紅色)生物素標(biāo)記的探針，用抗生物素蛋白-FITC顯示(綠色)1.熒光染色體原位雜交(FluorescenceinsituHybridization；FISH)基本原理是將DNA探針用熒光染料標(biāo)記，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體上，來檢測(cè)DNA序列在染色體上的定位。

2.比較基因組原位雜交(ComparativeGenomicHybridization；CGH)由原位雜交發(fā)展起的一些新技術(shù)自學(xué)雜交基本流程（一）核酸分子與固相介質(zhì)的結(jié)合1.噬菌體/克隆的轉(zhuǎn)移2.從凝膠上轉(zhuǎn)移DNA:毛細(xì)轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)移（二）核酸的固定：烘烤（80℃，2h）、紫外、堿（三）雜交：預(yù)雜交、雜交、洗脫（四）雜交信號(hào)的檢測(cè)：放射自顯影、非放射性雜化分子的檢測(cè)核酸分子的濃度和長(zhǎng)度：

50～300bp,0.1～0.5g2.溫度:Tm-25℃3.離子強(qiáng)度:Na+濃度約為1mol/L4.雜交液中的甲酰胺:50%甲酰胺,降低Tm5.核酸分子的復(fù)雜性6.非特異性雜交反應(yīng):封閉影響雜交的因素常用封閉物：①變性非特異DNA：鮭魚精子DNA， 小牛胸腺DNA②高分子化合物：Denhardt溶液 脫脂奶粉核酸雜交分類表雜交方法適用范圍Southern印跡檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分開的DNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上Northern印跡檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分開的RNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交檢測(cè)未經(jīng)分離的、固定在膜上的DNA或RNA分子菌落或噬菌斑雜交檢測(cè)固定在膜上的、經(jīng)裂解后從細(xì)菌或噬菌體中釋放出的DNA分子原位雜交檢測(cè)細(xì)胞或組織中的DNA或RNA分子教學(xué)內(nèi)容核酸分子雜交的基本原理

核酸探針

核酸分子雜交技術(shù)方法

DNA芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)采用類似集成電路制作中的微加工技術(shù)，將生命科學(xué)研究中的若干不連續(xù)過程（如樣品制備、生化反應(yīng)、檢測(cè)和分析步驟）集成到一塊幾平方厘米的芯片上，使這些分散的過程連續(xù)化與微型化，實(shí)現(xiàn)對(duì)大量生物樣品中的各種數(shù)據(jù)的快速、自動(dòng)和并行處理和分析。芯片技術(shù)微陣列芯片