研究生轉染二

真核細胞轉染實驗二一、熒光顯微鏡的工作原理二、熒光蛋白的應用2.1熒光顯微鏡熒光顯微鏡（fluorescencemicroscope）

用一定波長（短波長）的光作激發(fā)光源照射被檢標本，使標本的熒光物質受激發(fā)后產(chǎn)生人眼可見的熒光（長波長），再經(jīng)顯微鏡成像系統(tǒng)放大后用于對樣品結構或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。

熒光（fluorescence）物質中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉變?yōu)楦吣軤顟B(tài)（激發(fā)態(tài)），再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。短波光物質emission長波光excitation2.11熒光的種類自發(fā)熒光：物質受光激發(fā)產(chǎn)生的固有熒光。二次熒光：物質借熒光色素受光激發(fā)產(chǎn)生的熒光。自發(fā)熒光二次熒光激發(fā)光發(fā)射光2.12熒光的性質保持固有的熒光特性。熒光波長＞激發(fā)波長（STOKES法則）。熒光強度極小于激發(fā)光的強度。有不同程度的衰減。熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、pH值、熒光效率。2.13熒光顯微鏡的種類透射式落射式2.14熒光顯微鏡的主要部件

透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡暗場聚光鏡吸收濾色鏡

落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡濾光器3.141透射熒光顯微鏡的構造吸收濾色鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈箱透射熒光顯微鏡原理

目鏡吸收濾色鏡物鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈2.142落射熒光顯微鏡的構造落射熒光顯微鏡原理汞燈激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物鏡標本2.15落射熒光顯微鏡各部件特性和作用

汞燈光源:

提供激發(fā)光(U、V、B、G)

激發(fā)濾色鏡:

或稱初級濾片，置于光源與標本之間，只讓規(guī)定波長的激發(fā)光通過。nmT%BANDPASS

吸收濾色鏡:

或稱次級濾片，置于物鏡與目鏡之間,其作用是透射樣本發(fā)射的熒光，吸收未被標本吸收轉變的剩余紫外線等雜光，以排除其對熒光的干擾，并保護眼睛。

分色鏡:

在顯微鏡光路中呈45℃角的位置，反射短波長的激發(fā)光，同時透射長波長的熒光。＞A透過A＜A反射B＞B透過＜B阻擋nmnmT%T%2.15落射熒光顯微鏡各部件特性和作用2.16濾色鏡的選擇熒光素的特性濾色鏡的特性激發(fā)分色吸收—根據(jù)熒光素和濾色鏡的特性選擇濾色鏡激發(fā)濾色鏡帶寬對圖象的影響SWB:BP420-480WB:BP450-480WIB:BP460-490NB:BP470-490FITC+PI2.17熒光色素的選擇1.熒光染料：操作快，熒光強。2.熒光蛋白：特異性強，無毒害，可持續(xù)表達。2.18注意事項1.接通電源，使高壓汞燈進入預熱狀態(tài),幾分鐘后該燈便可達到穩(wěn)定工作狀態(tài)。2.開啟熒光顯微鏡后10min達到最大的效率，汞燈點亮15min內不要關燈，有助于保持燈的使用壽命，一旦關燈，須等3min后才能重新開啟。2.任何時候都不能讓細胞處于干燥狀態(tài)，封片前應將標本玻片浸在PBS中。3.每種熒光染料，均有自己的最適、PH值，此時熒光最強。熒光檢測時要在一定的PH值的緩沖液中進行。5.油鏡觀察時應使用專門的無熒光鏡油。CCDcameraConfocal

ConfocalvsCCD細胞標本2.19ConfocalvsCCD激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)1）激光（Laser）單色，高強，方向性，偏振光；2）掃描成像（Scanning）；3）共聚焦（Confocal）；4）顯微鏡（Microscope）2.191共聚焦（Confocal）1）焦平面上的點和針孔位置呈物像關系（共軛）；2）非焦平面上的點所成的像被針孔屏蔽掉；3）最大限度減少了背景模糊像的干擾PMTxy焦平面上的點成像光路

PMTxy焦平面以下的點的成像光路PMTxy焦平面以上的點的成像光路（植物切片，60um）2.192掃描成像掃描成像兩層含義1）單個平面由點掃描生成；2）Z軸掃描（光學切片，細胞CT）(0.1um)三維各層面圖像三維影像重組Confocal最佳的圖像質量極高的靈敏度多種應用平臺掃描時間很長昂貴的成本CCD快速成像相對便宜的價格圖像質量不佳對快速成像是最佳選擇一、熒光蛋白（fluorescentprotein,FP）二、FP與靶序列（targetingsequence）的融合三、FP與完整目的基因的融合四、轉染后篩選2.2融合熒光蛋白在真核細胞中的熒光定位熒光蛋白1992年Prasher等成功維多利亞水母（Aequoreavictoria）克隆到綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）基因的cDNA。1994年Chalfie等首次實現(xiàn)在原核細胞中表達了GFP。分子量小，對轉染細胞毒性小，能在多種異源真核細胞中表達。多色突變體或新物種FP的誕生。GFP,RFP轉染CHO細胞熒光蛋白基因＋特異性靶序列Fluorescentprotein+KDELERFluorescentprotein+PTS1peroxisomeFluorescentprotein+NLSnucleusFP＋靶序列pEYFP-ERYFPN段融合calrecticulintargetingsequence。C端融合KDELERretentionsequence(Lys-Asp-Glu-Leu)

。pDsRed2-peoxiRFPC末端融合Peroxisomaltargetingsignal（PTS1）(Ser-Lys-Leu)

。pEYFP-ERpDsRed2-peoxiEndoplasmicreticulumoflivingCHOcellsdisplayedbyyellowfluorescentprotein(YFP)YFPlabelER,RFPlabelperoxisomesFP＋完整蛋