(第六章)第七章植物的胚培養(yǎng)和體外受精

第八章植物的胚培養(yǎng)和體外受精第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)第二節(jié)植物的離體授粉與受精第三節(jié)植物的胚培養(yǎng)實(shí)例第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)一、植物胚培養(yǎng)的含義二、植物胚培養(yǎng)的種類三、植物胚培養(yǎng)的應(yīng)用四、植物胚培養(yǎng)技術(shù)第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)一、植物胚培養(yǎng)的含義植物的胚培養(yǎng)（embryoidculture）：（狹義上）是指在無(wú)菌條件下，把植物的未成熟胚或成熟胚離體接種在特定培養(yǎng)基上進(jìn)行的培養(yǎng)。從廣義上，胚培養(yǎng)還應(yīng)包括含有胚的胚珠和子房培養(yǎng)以及與胚生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的胚乳培養(yǎng)在內(nèi)。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)二、植物胚培養(yǎng)的種類根據(jù)不同培養(yǎng)目的、培養(yǎng)材料的來(lái)源及部位分為4類：1、胚培養(yǎng)（狹義上）（1）成熟胚培養(yǎng)：指子葉已形成的種胚，僅提供一定溫度、濕度就可以發(fā)芽長(zhǎng)成植物體。如種子發(fā)芽。對(duì)成熟種子的胚進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織用作突變體誘導(dǎo)材料和轉(zhuǎn)基因受體材料等。（2）未成熟（幼胚）培養(yǎng)：胚齡處于原胚期、球型期、心型期、早魚雷期的幼胚的培養(yǎng)。這幾個(gè)時(shí)期幼胚從生理至形態(tài)均未成熟，提供一定溫度和濕度的不能發(fā)芽。主要對(duì)遠(yuǎn)緣雜種幼胚，“胚胎挽救”（embryorescue），以得到遠(yuǎn)緣雜種植株。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)2、胚珠培養(yǎng)：對(duì)象：（1）對(duì)發(fā)育早期（心形期或更早期）難分離的幼胚。（2）對(duì)成熟胚非常小的植物，如蘭科植物、顯花植物的寄生種和某些腐生種。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)3、子房培養(yǎng)：（1）授粉（受精）子房培養(yǎng)：對(duì)遠(yuǎn)緣雜交，使胚胎繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育。如對(duì)水稻遠(yuǎn)緣雜交（野×栽）的胚胎早期敗育。（2）未授粉（未受精）子房培養(yǎng)： 用于固定雜種優(yōu)勢(shì)的研究。如對(duì)水稻無(wú)融合生殖與雜種優(yōu)勢(shì)固定研究。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)4、胚乳培養(yǎng)：（1）成熟胚乳培養(yǎng)；（2）未成熟胚乳培養(yǎng)胚乳為特殊組織，影響胚生長(zhǎng)發(fā)育，遺傳組成獨(dú)特。被子植物胚乳為三倍體，培養(yǎng)目的為產(chǎn)生三倍體植株；裸子植物胚乳為單倍體，經(jīng)培養(yǎng)可得單倍體植株。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)5、試管受精（離體受精）：從花粉萌發(fā)到受精形成種子，從種子萌發(fā)到幼苗形成的整個(gè)過程，均在試管內(nèi)完成，稱試管受精或離體受精。指培養(yǎng)未受精的胚珠并在試管內(nèi)撒播花粉，使其受精形成具有生活力的種子。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)三、植物胚培養(yǎng)的應(yīng)用1、在遠(yuǎn)緣雜交中克服雜種不育；2、克服自交種子不育或生活力低；3、克服種子休眠，促進(jìn)種子發(fā)芽；4、產(chǎn)生單倍體、三倍體植株；5、繁殖稀有植物；6、使胚發(fā)育不全的植物獲得大量后代；7、克服核果類胚的后熟作用；8、用于種子生活力的快速測(cè)定；9、用于無(wú)融合生殖和雜種優(yōu)勢(shì)固定；10、用于突變體誘變和轉(zhuǎn)基因研究。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)1、在遠(yuǎn)緣雜交中克服雜種不育在遠(yuǎn)緣雜交中，往往由于胚發(fā)育不全而敗育或胚不能萌發(fā)等使遠(yuǎn)緣雜交不能成功，如果將這類胚在適當(dāng)時(shí)期取出（或利用其胚珠、子房），在合適培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，可使胚正常生長(zhǎng)而獲得雜種植株。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)2、克服自交種子不育或生活力低長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)繁殖的植物，具有形成種子的能力，但它們的種子常是無(wú)生活力的，如芭蕉屬有許多結(jié)籽品種在自然情況下種胚不萌發(fā)。雜交育種中以某些種的早熟種為母本而獲得的雜種，種子生活力低下，甚至經(jīng)過冷藏處理也不能萌芽。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)3、克服種子休眠，促進(jìn)種子發(fā)芽打破種子休眠情況有2種：（1）種胚發(fā)育不全；（2）抑制物質(zhì)抑制種胚發(fā)芽。不少植物的種子休眠期很長(zhǎng)，不利于植物有性繁殖和育種工作。通過離體胚培養(yǎng)可大大縮短其休眠期。如：一種蘋果（Weepingcrabapple<Malussp.>）的種子在土中需經(jīng)9個(gè)月才能萌發(fā)。經(jīng)離體胚培養(yǎng)后，48小時(shí)內(nèi)便開始萌發(fā)，4周內(nèi)形成可移栽的幼苗。至第5個(gè)月，苗高達(dá)1米。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)4、產(chǎn)生單倍體、三倍體植株

胚培養(yǎng)技術(shù)的一種新的應(yīng)用是用于通過遠(yuǎn)緣雜交定向的消除染色體而產(chǎn)生單倍體。即：在胚發(fā)生的最初幾次細(xì)胞分裂期間，染色體優(yōu)先地被排除而消失。結(jié)果形成了單倍體胚，呈現(xiàn)緩慢的生長(zhǎng)。但往往在受精后2～5天，出現(xiàn)胚乳解體，因此，需要通過培養(yǎng)其離體胚才能產(chǎn)生單倍體植株。經(jīng)染色體加倍后，便能生產(chǎn)出純系的植株。對(duì)胚乳（三倍體）的培養(yǎng)，即可得到三倍體植株。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)5、繁殖稀有植物有些稀有植物的種子在自然界里不能萌發(fā)，但經(jīng)胚培養(yǎng)可容易地獲得幼苗。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)6、使胚發(fā)育不全的植物獲得大量后代一些寄生植物或腐生植物，如蘭花、天麻等，在種子成熟時(shí)，（由于）種子里包含著未分化的胚，有的胚只有6～7個(gè)細(xì)胞，即處于原胚階段，故種子成熟后，由于胚乳不發(fā)育（不良），胚不能獲得所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，大多數(shù)的胚不能成活。倘若在果實(shí)達(dá)八成成熟度時(shí)，將胚分離出來(lái)培養(yǎng)，便能繼續(xù)生長(zhǎng)，發(fā)育成正常植株。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)7、克服核果類胚的后熟作用在核果類植物的早熟品種育種工作中，常遇到一個(gè)辣手的問題就是果實(shí)的早熟性往往伴隨產(chǎn)生無(wú)生活力的種子。故早熟品種用一般種子繁殖法很難獲得雜種后代。采用離體幼胚培養(yǎng)法便可獲得雜種后代。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)8、用于種子生活力的快速測(cè)定離體胚培養(yǎng)是一種比常規(guī)用的種子活力染色法更為可靠和精確的方法（Barton,1961）。測(cè)定休眠后的種子生活力，應(yīng)用一般的種子萌發(fā)試驗(yàn)需很長(zhǎng)時(shí)間，特別是木本植物需要層積處理打破休眠。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)9、用于無(wú)融合生殖和雜種優(yōu)勢(shì)固定通過對(duì)子房、幼胚等培養(yǎng)，獲得無(wú)融合生殖的成熟種胚及后代植株。通過胚珠培養(yǎng)獲得“多胚苗”，“固定”雜種優(yōu)勢(shì)。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)10、用于突變體誘變和轉(zhuǎn)基因研究因?yàn)槌墒旆N子可以貯用，所以進(jìn)行成熟種胚培養(yǎng)時(shí)可以不受季節(jié)、氣候、環(huán)境等外界條件的限制，也不易受微生物的侵染（因有種殼、種皮在外保護(hù)），取材方便，易于消毒滅菌和接種培養(yǎng)，培養(yǎng)效率高。利于同步獲得大量和均一的愈傷組織或胚性細(xì)胞團(tuán)，作為突變體誘變的供體材料和轉(zhuǎn)外源基因的受體材料。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)四、植物胚培養(yǎng)技術(shù)1、離體胚培養(yǎng)技術(shù)2、胚珠培養(yǎng)技術(shù)3、子房培養(yǎng)技術(shù)4、胚乳培養(yǎng)技術(shù)第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)1、離體胚培養(yǎng)技術(shù)（1）成熟胚培養(yǎng)技術(shù)（2）未成熟胚（幼胚）培養(yǎng)技術(shù)2、胚珠培養(yǎng)技術(shù)3、子房培養(yǎng)技術(shù)（1）授粉（受精）子房培養(yǎng)技術(shù)（2）未授粉（未受精）子房培養(yǎng)技術(shù)4、胚乳培養(yǎng)技術(shù)（1）成熟胚乳培養(yǎng)技術(shù)（2）未成熟胚乳培養(yǎng)技術(shù)第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)1、離體胚培養(yǎng)技術(shù)（1）選取材料（2）材料滅菌（3）胚的剝離（4）胚培養(yǎng)基（5）培養(yǎng)條件第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)（1）選取材料選材要求：一是胚容易節(jié)離；二是數(shù)量多，而且遺傳上和發(fā)育時(shí)期均較一致。對(duì)種間或?qū)匍g雜交（遠(yuǎn)緣雜交）的幼胚進(jìn)行培養(yǎng)，要選擇合適的胚齡，胚齡太小胚培養(yǎng)不易存活，胚齡太大胚可能已改育或死亡。不同植物胚培養(yǎng)對(duì)胚齡有不同要求。原則：必須在胚開始敗育之前切離胚供培養(yǎng)。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)（2）材料滅菌在剝離胚之前，根據(jù)所用材料之不同，對(duì)整個(gè)種子、子房或胚珠甚至整個(gè)未成熟的果實(shí)按常規(guī)滅菌方法作表面滅菌。（3）胚的剝離合子胚由于發(fā)育程度不同分有成熟胚和未成熟胚。不同植物間合子胚的大小也有很大差別。因此剝離合子胚的難易程度有所不同。通常成熟胚和體積較大的容易剝離，未成熟胚和體積小的胚難剝離。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)剝離胚時(shí)須根據(jù)種子的結(jié)構(gòu)和胚的大小與剝離的難易等不同采用不同的無(wú)菌器械，如解剖針或接種針、尖頭鑷子和具柄解剖刀等。體積小的胚還須借助體視顯微鏡（90X），使用冷光源。剝離胚時(shí)，不管是成熟胚或未成熟胚，均需小心操作，切莫傷害胚及其胚柄。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)（4）胚培養(yǎng)基培養(yǎng)基的組成是胚培養(yǎng)成敗的最關(guān)鍵條件。合適的培養(yǎng)基能夠使離體胚漸進(jìn)地、有序地按其固有的發(fā)育期正常發(fā)育至成熟并萌發(fā)長(zhǎng)成植株。對(duì)成熟胚來(lái)說，只需在含有無(wú)機(jī)鹽和糖的培養(yǎng)基上就能正常生長(zhǎng)成幼苗。但對(duì)未成熟的幼胚（子葉期以前的各期胚結(jié)構(gòu)）來(lái)說，對(duì)培養(yǎng)基的要求就比較復(fù)雜，對(duì)所用培養(yǎng)基可從下面幾個(gè)方面考慮：第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)①基本培養(yǎng)基：可用MS、White、Tukey、Norstog等。②糖類：常用蔗糖，它是離體的成熟胚和未成熟胚培養(yǎng)所必需的最合適的糖。一般使用濃度為2%左右。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)③氨基酸和維生素：培養(yǎng)基中加入合適的氨基酸等有機(jī)氮化合物，可以明顯改善幼胚生長(zhǎng)狀況。Hanning(1904)發(fā)現(xiàn)精氨酸有效地促進(jìn)胚的生長(zhǎng)。Rijven（1955）發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺能促進(jìn)9種不同科的有花植物胚的生長(zhǎng)，其促進(jìn)效果比精氨酸好得多。對(duì)植物離體胚的生長(zhǎng)來(lái)說，就單種氨基酸而言，谷氨酰胺是最有效的。酪蛋白水解物（CH）是一種氨基酸復(fù)合物，廣泛地被用作胚培養(yǎng)基的附加物。一般使用濃度為400～500mg·L-1。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)可供胚培養(yǎng)用的維生素有硫胺素、呲哆醇、煙酸、生物素、肌醇等。對(duì)于已成熟的發(fā)育完全的胚來(lái)說，維生素并非必需，但對(duì)未成熟的幼胚來(lái)說，某些維生素是必需的。因此，培養(yǎng)某種離體胚時(shí)，是否需要維生素，需要哪種維生素，應(yīng)通過試驗(yàn)性的試驗(yàn)來(lái)確定。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)④天然的提取物：由于胚在植物體內(nèi)是靠其胚乳滋養(yǎng)的，因此在幼胚培養(yǎng)中，人們就自然地應(yīng)用一些植物胚乳或其提取物作為培養(yǎng)基的成分。（前已提及，李繼桐和沈同（1934）發(fā)現(xiàn)銀杏胚乳提取物對(duì)培養(yǎng)的銀杏胚生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。又如，加入非熱壓滅菌的椰子乳（CM），對(duì)幼胚培養(yǎng)有很好的效果。）第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)⑤植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：離體培養(yǎng)的成熟胚通常是不需要外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的。Monnier（1978）指出，胚培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，會(huì)引起胚結(jié)構(gòu)異常。他認(rèn)為胚對(duì)大多數(shù)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是自給的。但也有不少報(bào)道認(rèn)為加入適量的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，對(duì)刺激胚（特別是幼胚）的生長(zhǎng)發(fā)育和萌發(fā)有促進(jìn)作用。常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有：IAA、KT、ABA、GA3（對(duì)處于休眠期的胚有很好的破除休眠的作用）和2.4-D、NAA（用于誘導(dǎo)胚生長(zhǎng)的同時(shí)誘導(dǎo)愈傷組織）。不同植物和不同胚發(fā)育時(shí)期對(duì)激素的需要和反應(yīng)是不同的。通常低濃度的激素對(duì)胚生長(zhǎng)有利，高濃度則否。特別是生長(zhǎng)素，容易誘導(dǎo)胚產(chǎn)生愈傷組織。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)⑥培養(yǎng)基的pH：培養(yǎng)基的pH值對(duì)幼胚的生長(zhǎng)與發(fā)育有明顯影響。不同種類的植物或不同發(fā)育（時(shí)）期的幼胚對(duì)pH值要求不同。一般要求pH值在5～7。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)（5）培養(yǎng)條件：①溫度：對(duì)大多數(shù)植物來(lái)說，胚培養(yǎng)所要求的合適溫度為25～30℃。但不同植物的胚對(duì)溫度要求也有很大差別。例如，水稻胚培養(yǎng)適溫為30℃，棉花幼胚為32℃。但有些植物幼胚培養(yǎng)要求低溫。如：馬鈴薯胚培養(yǎng)在20℃時(shí)生長(zhǎng)最好。百合胚培養(yǎng)需要17℃，為打破其休眠，尚需4℃冷處理。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)②光照條件：由于胚在母體植株上被包埋在胚珠內(nèi)，因此，認(rèn)為胚培養(yǎng)時(shí)對(duì)光照無(wú)特別要求。一般認(rèn)為培養(yǎng)在光照12小時(shí)黑暗12小時(shí)的光周期下對(duì)胚芽生長(zhǎng)較好，但對(duì)根生長(zhǎng)有抑制。光照強(qiáng)度一般以2000Lx為宜。先黑暗中培養(yǎng)7～14天，再移至光下培養(yǎng)。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)2、胚乳培養(yǎng)技術(shù)（1）胚乳發(fā)育時(shí)期雙受精后的胚乳核，先分裂形成游離核。這一時(shí)期的胚乳稱為“游離核期”。繼續(xù)發(fā)育后形成細(xì)胞壁，即形成許多小的細(xì)胞。這一時(shí)期稱為“胚乳細(xì)胞期”?！坝坞x核期”的胚乳離體培養(yǎng)很難成功；“細(xì)胞期”的胚乳離體培養(yǎng)成功率較高。第一節(jié)植物的胚培養(yǎng)（2）胚性因子（Embryofactor）的作用帶胚培養(yǎng)，利于形成愈傷組織。（3）培養(yǎng)基酸堿度對(duì)胚乳組織培養(yǎng)的影響。第二節(jié)植物的離體授粉與受精一、離體受精的概念和意義二、離體受精的方法三、離體受精成功的技術(shù)關(guān)鍵第二節(jié)植物的離體授粉與受精一、離體受精的概念和意義1、概念從花粉萌發(fā)到受精形成種子，從種子萌發(fā)到幼苗形成的整個(gè)過程，均在試管內(nèi)完成，稱離體受精，體外受精（invitrofertilization），或試管受精（test-tubefertilization）。2、意義：離體受精技術(shù)在克服植物受精不育障礙，特別是克服花粉在柱頭上不萌發(fā)或萌發(fā)后花粉管不能伸入花柱，或在花柱中生長(zhǎng)緩慢，使配子不能如期融合的障礙有著極其重要的意義。第二節(jié)植物的離體授粉與受精二、離體受精的方法將未授粉的子房，經(jīng)表面滅菌后，取出胚珠，接種在培養(yǎng)基上。然后，在試管內(nèi)撒播花粉。花粉發(fā)芽后，花粉管長(zhǎng)入胚珠內(nèi)受精，受精后的胚珠進(jìn)一步發(fā)育形成種子，種子能在培養(yǎng)基上發(fā)芽長(zhǎng)成植株。第二節(jié)植物的離體授粉與受精離體受精的具體作法：（5種）1、從胎座上切下單個(gè)胚珠（裸露胚珠），接種在培養(yǎng)基上，然后撒播花粉的方法。2、帶著完整胎座或部分胎座接種并撒播花粉的方法。3、帶著完整子房或部分子房壁接種并撒播花粉的方法。由于帶著完整子房，對(duì)于解央花粉和柱頭，花粉管和花柱兩種形式的受精障礙不起作用。故發(fā)展到切去柱頭和花柱直接在子房上散布花粉的作法。如煙草試管受精（Dulieu,1966）第二節(jié)植物的離體授粉與受精4、柱頭接近法。將花粉撒在本種植物的柱頭上，切下柱頭接種在培養(yǎng)基上。然后在柱頭周圍，接種異種裸露胚珠，花粉在本種植物的柱頭哺育下發(fā)芽，花粉管伸長(zhǎng)并進(jìn)入胚珠受精。這一方法是解決花粉發(fā)芽和胚珠培養(yǎng)，在培養(yǎng)基組成上發(fā)生矛盾時(shí)，所采用的一種方法。5、哺育法。將胚珠表面先蘸滿有助于花粉發(fā)芽的培養(yǎng)基接種培養(yǎng)，然后在胚珠上撒播花粉使之受精。這一方法是解決胚珠存活率和花粉發(fā)芽、花粉管伸長(zhǎng)培養(yǎng)基發(fā)生矛盾時(shí)的作法。第二節(jié)植物的離體授粉與受精三、離體受精成功的技術(shù)關(guān)鍵1、離體胚珠的成活率和受精力試管受精的成功率與胚珠的成分活率有著密切關(guān)系。提高離體胚珠成活率的關(guān)鍵是培養(yǎng)基。因此要對(duì)培養(yǎng)基的各種成分進(jìn)行詳細(xì)的篩選。諸如基本培養(yǎng)基、激素種類和濃度、滲透壓、pH值等。適宜胚珠離體培養(yǎng)而且成活率很高的培養(yǎng)基，往往不能使花粉萌發(fā)或不能使萌發(fā)后的花粉管伸長(zhǎng)。為此需同時(shí)篩選有利于花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)的培養(yǎng)基。第二節(jié)植物的離體授粉與受精2、花粉萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)速度試管內(nèi)撒粉后，如何保證花粉迅速發(fā)芽，并且有較高的發(fā)芽率；花粉管能迅速伸長(zhǎng)并在受精允許的時(shí)間內(nèi)到達(dá)胚囊，其關(guān)鍵仍然是培養(yǎng)基。因此需對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)的適宜培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。培養(yǎng)基篩選中要注意鈣和硼對(duì)促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)的作用。第二節(jié)植物的離體授粉與受精3、花粉的滅菌試管受精是在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所以花粉必須先進(jìn)行滅菌。目前常用的花粉滅菌方法如下：（1）用新鮮花蕾浸漬滅菌，然后剝出花粉使用。由于花粉粘連，撒播不均勻，因而影響撒播質(zhì)量。如若待藥囊自行裂開后再用，但又不能保證花粉具有高的萌發(fā)率和受精力（率）。（2）紫外線照射滅菌，照射時(shí)間約15min，但滅菌效果和受精率有一定的矛盾，因此要在滅菌率、發(fā)芽率、受精率三者之間篩選最適宜的照射時(shí)間。第二節(jié)植物的離體授粉與受精4、鑒別受精的標(biāo)記性狀試管內(nèi)的胚珠撒播花粉后，如何辨別受精與否呢？那就需要標(biāo)記性狀。玉米“胚乳直感”現(xiàn)象，是試管受精的優(yōu)良標(biāo)記性狀。白色胚乳（♀）×紫色胚乳（♂）↓

F1代（胚乳紫色）第三節(jié)植物的胚培養(yǎng)實(shí)例一、水稻野栽雜交及胚胎培養(yǎng)研究國(guó)際水稻研究所植物育種與遺傳生化系IRRI(InternationalRiceResearchInstitute)PBGBDivision(PlantBreedingandGeneticBiochemistryDivision)Dr.G.S.Khush;Dr.Bra