微衛(wèi)星多重PCR擴(kuò)增技術(shù)

魚(yú)類(lèi)育種學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：微衛(wèi)星多重PCR擴(kuò)增技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誗SR分子標(biāo)記技術(shù)的原理與分析方法；學(xué)習(xí)多重PCR技術(shù)，了解體系優(yōu)化的方法；掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法；掌握銀染的實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)一PCR反應(yīng)及體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)材料與儀器材料：團(tuán)頭魴DNA模板（濃度：100ng/μl）儀器用具：PCR儀，制冰機(jī)，紫外反射投射檢測(cè)儀，微量移液器，冰箱，天平，電泳儀，電泳槽，燒杯，量筒，200ulPCR管，Taq酶，dNTPs，引物，PCR緩沖液，石蠟油，電泳所需試劑，溴酚藍(lán)，瓊脂糖，硼酸，Tris堿，蒸餾水，離心管。實(shí)驗(yàn)步驟PCR反應(yīng)液配置－PCR擴(kuò)增－產(chǎn)物檢測(cè)－程序優(yōu)化－PCR擴(kuò)增－產(chǎn)物檢測(cè)－結(jié)果分析多重PCR擴(kuò)增體系為20μl：包括100ng基因組DNA，1×PCR緩沖液，Mg2+(1.5mmol/L)，1UTaq酶，dNTPs0.2mmol/L，多重PCR擴(kuò)增體系內(nèi)各位點(diǎn)上、下游引物分別為0.25μmol/L試劑體積三重PCR體系(μl)四重PCR體系(μl)H2O13.713.2Buffer2.02.0Mg2+1.21.2dNTP0.40.4Primer-1(F/R)0.25+0.250.25+0.25Primer-2(F/R)0.25+0.250.25+0.25Primer-3(F/R)0.25+0.250.25+0.25Primer-4(F/R)--0.25+0.25Taq酶0.20.2DNA(100ng/μl)11Total20μl20μl體系名稱(chēng)引物組合產(chǎn)物大小3-7Mam_EST811290-320Mam_EST129200-250Mam_EST64140-1704-5Mam_EST179360-400Mam_EST11290-330Mam_EST90200-250Mam_EST37140-180PCR程序：95C3min95C30sTa30s32cycles72C45s72C5min4Cforever

注：對(duì)Ta進(jìn)行梯度優(yōu)化，設(shè)置4個(gè)溫度梯度－50，54，58，62。聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液配置：5×TBE：54gTris堿，27.5g硼酸，20ml0.5mol/LEDTA（pH8.0），加ddH2O定容至1000ml。40％丙烯酰胺：380g丙烯酰胺，20g甲叉-丙烯酰胺，加ddH2O定容至1000ml。0.5mol/LEDTA（pH8.0）：186.1gEDTA?Na?2H2O，800mlddH2O，NaOH調(diào)pH至8.0（about20gNaOH），加ddH2O定容至1000ml，高壓滅菌。10％APS：1gAPS，加ddH2O定容至10ml，置于4C。8%non-denaturingPAGEgel:

40%丙烯酰胺14mlddH2O41ml5×TBE14ml10％APS650μlTEMED65μl染色液－0.1％AgNO3：0.5gAgNO3，加ddH2O定容至500ml，置于4C。顯色液：10gNaOH，0.2gNaCO3，ddH2O定容至500ml，置于4C保存，用時(shí)加2ml37％formaldehyde。固定液－10％冰醋酸銀染步驟：1.取下凝膠用去離子水冼膠2min；2.0.1%硝酸銀染色10－15min；3.棄去染色液,蒸餾水洗膠30s；4.顯色液顯色15秒,換用新的顯色液,顯清條帶為止；5.