課題3分解纖維素微生物分離2013.6.4

課題３分解纖維素的微生物的分離（一）纖維素與纖維素酶1、纖維素

纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是含量最豐富的多糖類物質(zhì)。一、基礎(chǔ)知識(shí)植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。土壤中某些微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶,把纖維素分解為葡萄糖，后再利用。纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過(guò)70億噸，其中40%-60%能被土壤中能產(chǎn)生纖維素酶的微生物所利用，不會(huì)大量積累。

在草食性動(dòng)物等的消化道內(nèi)，也共生有分解纖維素的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒(méi)有分解纖維素的能力。

人類可應(yīng)用分解纖維素的微生物將秸稈等廢棄物轉(zhuǎn)變成酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。2、纖維素酶

纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶(外切酶)、CX酶(內(nèi)切酶)和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纖維素①取二支20mL的試管②各加入一張濾紙條③各加入pH4.8，物質(zhì)量為0.1mol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖液11ml和10ml④在乙試管中加入1mL纖維素酶⑤兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min的搖床上振蕩1h⑥結(jié)果：乙試管的濾紙條消失實(shí)驗(yàn)：纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗(yàn)甲乙

討論：乙試管的濾紙條為什么會(huì)消失？甲試管的作用是什么？本實(shí)驗(yàn)的自變量是纖維素酶的有無(wú)。自變量的操縱方法是：在一支試管中添加適量（1mL）的纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素酶，但需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，否則會(huì)影響溶液的pH。實(shí)驗(yàn)分析：P27的小實(shí)驗(yàn)是如何構(gòu)成對(duì)照的？剛果紅染色法原理：剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。

當(dāng)我們?cè)诤欣w維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復(fù)合物就無(wú)法形成，培養(yǎng)基中就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，這樣我們就可以通過(guò)是否產(chǎn)生透明圈來(lái)篩選纖維素分解菌。（二）纖維素分解菌的篩選哪種纖維素分解菌分解纖維素的能力最強(qiáng)？二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

請(qǐng)你根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程圖和提供的三個(gè)資料以及“操作提示”，在思考有關(guān)問(wèn)題的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出一個(gè)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布在鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上篩選產(chǎn)生透明圈的菌落操作步驟1、土壤取樣：①分布環(huán)境：富含纖維素的環(huán)境中②原因

生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對(duì)提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。③實(shí)例：樹(shù)林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。④討論:如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋在土壤中多深？

將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對(duì)集中，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm左右的土壤中。2、選擇培養(yǎng)

①目的：

增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。②制備選擇培養(yǎng)基：③操作：

將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)1～2天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復(fù)選擇培養(yǎng)。

培養(yǎng)基成分分析培養(yǎng)基組成提供主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)纖維素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、無(wú)機(jī)鹽KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g無(wú)機(jī)鹽酵母膏0.5g生長(zhǎng)因子、碳源、氮源水解酪素0.5g氮素、生長(zhǎng)因子溶解后，蒸餾水定容至1000mL水P29：回答下列問(wèn)題1、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？

是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無(wú)凝固劑（瓊脂）。2、這個(gè)培養(yǎng)基對(duì)微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進(jìn)行選擇的？有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。3、你能否設(shè)計(jì)一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明選擇培養(yǎng)基的作用？自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。可用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對(duì)照，或者將纖維素改為葡萄糖。

說(shuō)明：分析“纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方”可知，該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖。只不過(guò)，由于酵母膏的含量極少，因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。P29旁欄思考題：為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。比較項(xiàng)目分解尿素的細(xì)菌纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基原理培養(yǎng)基類型目的鑒定培養(yǎng)基原理現(xiàn)象方法將細(xì)菌涂布在只有尿素做氮源的選擇培養(yǎng)基上將細(xì)菌涂布在只有纖維素粉做碳源的選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株選擇培養(yǎng)纖維素分解菌與分解尿素的細(xì)菌選擇和鑒定知識(shí)的比較思考：本實(shí)驗(yàn)的流程與課題2中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？

本實(shí)驗(yàn)流程與課題2的流程的區(qū)別如下：課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題通過(guò)選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋101～107倍。3、梯度稀釋1011021031041051064、將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上（1）制備鑒別培養(yǎng)基

鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基（2）涂布平板：將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)基組成提供的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生長(zhǎng)因子KH2PO40.25g無(wú)機(jī)鹽土豆汁100mL碳源、生長(zhǎng)因子瓊脂15g凝固劑上述物質(zhì)溶解后，加蒸餾水定容至1000mL氫元素、氧元素

5、剛果紅染色法挑選產(chǎn)生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。方法一：先

，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。方法二：在

時(shí)就加入剛果紅。倒平板培養(yǎng)微生物思考：方法一中NaCl溶液的作用？

漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實(shí)際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細(xì)菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個(gè)多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當(dāng)然分解纖維素的能就強(qiáng)！這兩種染色方法各有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？（見(jiàn)優(yōu)化方案P23要點(diǎn)一）染色法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅方法二：倒平板時(shí)加入剛果紅顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用操作繁瑣，剛果紅會(huì)使菌落之間發(fā)生混雜操作簡(jiǎn)便，不存在菌落混雜問(wèn)題1、產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈2、有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。比較項(xiàng)目分解尿素的細(xì)菌纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基原理培養(yǎng)基類型目的鑒定培養(yǎng)基原理現(xiàn)象方法將細(xì)菌涂布在只有尿素做氮源的選擇培養(yǎng)基上將細(xì)菌涂布在只有纖維素粉做碳源的選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株選擇培養(yǎng)纖維素分解菌與分解尿素的細(xì)菌選擇和鑒定知識(shí)的比較在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高。在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如果pH升高指示劑會(huì)變紅。剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶催化分解后紅色復(fù)合物無(wú)法形成，培養(yǎng)基上就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。觀察菌落周圍是否有著色的環(huán)帶出現(xiàn)來(lái)鑒定尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來(lái)篩選纖維素分解菌脲酶檢測(cè)法剛果紅染色法

在產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，挑取并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在300C－370C培養(yǎng)，可獲得純化培養(yǎng)。6、純化培養(yǎng)四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1、培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落。

對(duì)照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有菌落生長(zhǎng)則說(shuō)明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說(shuō)明可能獲得了分解纖維素的微生物。2、分離的結(jié)果是否一致。

由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。

為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進(jìn)行_______________實(shí)驗(yàn)，纖維素酶的發(fā)酵方法有______發(fā)酵和______發(fā)酵。纖維素酶測(cè)定方法是對(duì)纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的________含量進(jìn)行定量測(cè)定。發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

液體

固體

葡萄糖

五、課題延伸分解纖維素的微生物的分離纖維素酶種類、作用、催化活力剛果紅染色篩選原理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)土壤取樣選擇培養(yǎng)涂布培養(yǎng)梯度稀釋前置染色法后置染色法富含纖維