流式細(xì)胞技術(shù)課件

第15章流式細(xì)胞技術(shù)的原理和應(yīng)用陳鯉翔副教授Email：lxchen@流式細(xì)胞技術(shù)（Flowcytometry,FCM)

是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速對(duì)單個(gè)細(xì)胞或其他生物微粒（如細(xì)菌）的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。流式細(xì)胞儀是測(cè)量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析儀，是在單個(gè)細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的對(duì)細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進(jìn)行快速測(cè)量并可分類收集的高技術(shù)。30年代：設(shè)想使細(xì)胞檢測(cè)自動(dòng)化50-60年代：分層鞘流原理、分光光度計(jì)定量細(xì)胞成分及結(jié)合測(cè)量值對(duì)細(xì)胞分類，提出細(xì)胞分選70年代：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)1973年：第一臺(tái)商用流式細(xì)胞儀FACSI發(fā)展方向：熒光染料的開發(fā)、細(xì)胞的制備方法、提高電子信號(hào)的處理能力等流式細(xì)胞儀的發(fā)展史BD公司流式細(xì)胞儀FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSVantageFACSAriaMoFloAstriosEQ超高速流式分選系統(tǒng)Gallios流式細(xì)胞儀Beckman公司流式細(xì)胞儀Navios流式細(xì)胞分析系統(tǒng)測(cè)量速度快，最快可在1秒鐘內(nèi)計(jì)測(cè)數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，可以對(duì)同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)）、化學(xué)特性（如DNA、RNA）的多參數(shù)測(cè)量，并具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、顯微熒光光度技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、圖像技術(shù)等眾多領(lǐng)域的知識(shí)和成果；既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。細(xì)胞不被破壞，測(cè)量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)應(yīng)用：細(xì)胞生物學(xué)，腫瘤學(xué)，血液學(xué)，免疫學(xué)，藥理學(xué)，遺傳學(xué)及臨床檢驗(yàn)學(xué)等細(xì)胞組成細(xì)胞功能大小細(xì)胞表面/胞漿/核--特異性抗原粒度細(xì)胞活性DNA,RNA含量胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子,PH值,膜電位酶活性流式細(xì)胞儀常檢測(cè)的細(xì)胞特性液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)一、流式細(xì)胞技術(shù)原理1、流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)：由樣本和鞘液組成待測(cè)細(xì)胞 單個(gè)細(xì)胞的懸液 熒光染料標(biāo)記的單抗對(duì)其染色受清潔氣體壓力 從樣品管進(jìn)入流動(dòng)室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測(cè)的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。

（1）液流系統(tǒng)FluorescenceSignalFocusedLaserBeamShealthFluid液流系統(tǒng)示意圖InjectorTip樣本管鞘液管激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長(zhǎng)/短波長(zhǎng)，通過(guò)短/長(zhǎng)波長(zhǎng)光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光），F(xiàn)L1,FL2,FL3,FL4（熒光）（2）光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)示意圖散射光的測(cè)定

細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍360°立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。光信號(hào)的測(cè)定

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度(0.5°~10°)向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。

側(cè)向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90°角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。 測(cè)得的FS與SS信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞光散射測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過(guò)波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。線性放大器和對(duì)數(shù)放大器熒光測(cè)定熒光補(bǔ)償FITCAPCPEPerCP/Cy5.5每一種熒光分子都發(fā)射某一特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光，然而這些熒光的發(fā)射光譜會(huì)發(fā)生重疊，有時(shí)這種重疊現(xiàn)象非常顯著。熒光補(bǔ)償是指修正熒光滲漏的過(guò)程，如從探測(cè)器除去除匹配熒光以外的任何熒光信號(hào)。熒光補(bǔ)償PEFITCPE+cellsFITC+cellsTodocolourcompensation:ForPureFITC+cells,=PEsignal-%FITCsignalForPurePE+cells,=FITCsignal-%PEsignalAftercompensationPEFITCPE+cellsFITC+cellsGOODcompensation:Y-meanoftheFITCcell=theY-meanof-/-cellsX-meanofthePEcell=theX-meanof-/-cellsPEFITCPE+cellsFITC+cellsOVERcompensation細(xì)胞懸液形成液流柱流動(dòng)室振動(dòng)液流斷裂成液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)不充電充電細(xì)胞分選分選速度：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率。分選收獲率：實(shí)際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過(guò)測(cè)量點(diǎn)的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實(shí)際得率。與分選速度成反比。分選的技術(shù)要求（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少參數(shù)單參數(shù)直方圖雙參數(shù)點(diǎn)圖、二維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析數(shù)據(jù)顯示方式由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。單參數(shù)直方圖雙參數(shù)點(diǎn)圖雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。

用等高線來(lái)表示細(xì)胞數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞數(shù)相同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。二維等高圖三參數(shù)直方圖

三維坐標(biāo)勻?yàn)閰?shù)（散射光或熒光）而非細(xì)胞數(shù)。多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。一般利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設(shè)門（Gate)技術(shù)，來(lái)分析參數(shù)之間的相互關(guān)系。多參數(shù)分析Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。門（Gate）設(shè)置A淋巴細(xì)胞B單核細(xì)胞C中性粒細(xì)胞A、B、C均為任意門區(qū)閾（region,R）與門(gate,G)是兩個(gè)相關(guān)的概念，區(qū)閾可與門對(duì)應(yīng)，但是也可以包含于門。Region設(shè)置D1CD4+/CD3-D2CD4+/CD3+D3CD4-/CD3-D4CD4-/CD3+如十字門分析時(shí)，就可以由四個(gè)區(qū)域構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。樣本制備：?jiǎn)渭?xì)胞懸液標(biāo)記染色：光譜不重疊陰性對(duì)照的設(shè)置：檢測(cè)標(biāo)本的重復(fù)性質(zhì)量控制二、流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求

外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備：淋巴細(xì)胞分離液分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞。Ficoll，40kd，高密度，低滲透壓，無(wú)毒性。（比重為1.0177±0.001的分層液)樣本制備

利用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，得到外周血中所有白細(xì)胞的流式細(xì)胞分析的二維散色光點(diǎn)圖。培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備：?jiǎn)螌优囵B(yǎng)細(xì)胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來(lái)，然后離心漂洗。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，可不用酶消化，直接吹打制備成單細(xì)胞懸液。新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備機(jī)械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法。酶處理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等?；瘜W(xué)試劑處理法：EDTA、EGTA等。表面活性劑處理法：Triton-x100、皂素等。防止細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞膜原有的特性保存的方法：1、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。2、乙醇與甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。3、甲醛或多聚甲醛固定法：細(xì)胞不具有生物活性，但細(xì)胞表面熒光染色分析不受影響。單細(xì)胞懸液的保存適用條件:有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)對(duì)488nm的激發(fā)光波長(zhǎng)有較強(qiáng)的吸收發(fā)射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)間有較大的波長(zhǎng)差易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性常用的熒光染料與標(biāo)記染色FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細(xì)胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復(fù)合染料藻膽蛋白類幾種常見的熒光染料名稱染料激發(fā)波長(zhǎng)熒光顏色溶解性對(duì)PH敏感性特點(diǎn)異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團(tuán)，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復(fù)合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過(guò)一個(gè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而檢測(cè)到該特定熒光信號(hào)。能量傳遞復(fù)合染料Laser488nmPECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復(fù)合染料機(jī)制熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方式 結(jié)構(gòu)親和式 嵌入結(jié)合 共價(jià)鍵結(jié)合 熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記方法 直標(biāo):干擾少,但需購(gòu)買多種單抗 間標(biāo):步驟多,干擾多,不需標(biāo)記多種抗體 組合標(biāo)記：免疫熒光標(biāo)記FITC+PE488525、575綠色、橙色FITC+Tred488525綠色

568615紅色FITC+PeCy5488525、675綠色、紅色FITC+ECD488525、625綠色、橙紅色F+P+PeCy5488525、575、675綠、橙、紅色F+ECD+PeCy5488525、575、675綠、橙紅色、紅色F+P+APC488525、575綠色、橙色

633670紅色熒光染料激發(fā)波長(zhǎng)（nm)發(fā)射波長(zhǎng)（nm)顏色雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)記適當(dāng)?shù)闹苽浞绞教幚砑t細(xì)胞實(shí)體組織來(lái)源標(biāo)本用機(jī)械法溫度25-37℃，PH7.0-7.2質(zhì)量控制單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控免疫熒光染色的質(zhì)控溫度PH染料濃度固定劑光路與流路校正:確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（CV）。PMT（光電倍增管）校準(zhǔn):保證樣品檢測(cè)時(shí)儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。絕對(duì)計(jì)數(shù)校準(zhǔn):保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。Flow-checkFlow-setFlow-count儀器操作的質(zhì)控同型對(duì)照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照，選用相同源性的未標(biāo)記單抗作為對(duì)照調(diào)整和設(shè)置電壓，以保證特異性。全程質(zhì)量控制：在流式檢測(cè)中，樣品標(biāo)記、溶血、洗滌、儀器質(zhì)量控制和上機(jī)檢測(cè)的過(guò)程都會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果。采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品來(lái)進(jìn)行全程質(zhì)控，使得同類實(shí)驗(yàn)室建立質(zhì)控比對(duì)，數(shù)據(jù)可以互用。免疫檢測(cè)的質(zhì)控三、流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用以細(xì)胞免疫功能測(cè)定為例淋巴細(xì)胞亞群活化的T淋巴細(xì)胞抗原特異性免疫細(xì)胞調(diào)控性T細(xì)胞樹突狀細(xì)胞先天免疫細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群T淋巴細(xì)胞(CD3+)名稱功能CD3+CD4+輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th/Ti)輔助和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-輔助性T細(xì)胞(Th)誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Ti)輔助細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細(xì)胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細(xì)胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T細(xì)胞(Ts)殺傷性T細(xì)胞(Tc)抑制細(xì)胞和體液免疫細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD3+CD4+CD8+活化的T細(xì)胞在T細(xì)胞惡性增生時(shí)升高

CD3+CD4-CD8-有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞,其表達(dá)

/T細(xì)胞受體(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/靜止的T淋巴細(xì)胞

當(dāng)免疫系統(tǒng)沒(méi)有能力更新輔助性或抑制性/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞時(shí)此細(xì)胞亞群較低

CD45RA-CD45RO+記憶性T淋巴細(xì)胞

病菌感染時(shí)升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T細(xì)胞,感染時(shí)升高

感染時(shí)升高淋巴細(xì)胞亞群活化T淋巴細(xì)胞名稱功能CD3+HLA-DR+活化T細(xì)胞CD4+HLA-DR+活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞CD4+CD25+活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味著HIV患者的預(yù)后較差B淋巴細(xì)胞(19+)CD19+CD23+活化的B細(xì)胞過(guò)敏患者中升高