實驗13經(jīng)典免疫技術

實驗十三經(jīng)典免疫技術實驗目的要求1、掌握直接凝集反應的原理和操作方法

2、熟悉免疫標記技術的原理和操作方法一、凝集反應為一種血清學反應。顆粒性抗原（完整的病原微生物或紅細胞等）與相應抗體結(jié)合，在有電介質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時間，出現(xiàn)肉眼可見的凝集小塊。參與凝集反應的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素?？煞譃橹苯幽磻烷g接凝集反應兩類。（一）實驗原理1、直接凝集反應（原理）顆粒狀抗原（如細菌、紅細胞等）與相應抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。分為玻片法和試管法。（1）玻片法是一種定性試驗方法?？捎靡阎贵w來檢測未知抗原。若鑒定新分離的菌種時，可取已知抗體滴加在玻片上，將待檢菌液一滴與其混勻。數(shù)分種后，如出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，為陽性反應。該法簡便快速，除鑒定菌種外，尚可用于菌種分型、測定人類紅細胞的ABO血型等。（2）試管法是一種定量試驗的經(jīng)典方法?？捎靡阎乖瓉頇z測受檢血清中有無某抗體及抗體的含量。用來協(xié)助臨床診斷或供流行病學調(diào)查研究。操作時，將待檢血清用生理鹽水連續(xù)成倍稀釋，然后加入等量抗原，最高稀釋度仍有凝集現(xiàn)象者，為血清的效價，也稱滴度，以表示血清中抗體的相對含量。診斷傷寒、副傷寒病的肥達反應、布氏病的瑞特氏反應均屬定量凝集反應。2、間接凝集反應將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關的、一定大小的顆粒狀載體的表面，然后與相應抗體（或抗原）作用。在有電介質(zhì)存在的適宜條件下，即可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反應。用做載體的微球可用天然的微粒性物質(zhì)，如人（O型）和動物（綿羊、家兔等）的紅細胞、活性炭顆粒或硅酸鋁顆粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯膠乳微球等。由于載體顆粒增大了可溶性抗原的反應面積，當顆粒上的抗原與微量抗體結(jié)合后，就足以出現(xiàn)肉眼可見的反應，敏感性比直接凝集反應高得多。YYY+（二）材料

標準抗A、抗B診斷血清；受測者紅細胞、鹽水、采血針、棉球、玻片等。待測細菌純培養(yǎng)物，標準診斷血清（三）方法（血型測定）1．取一塊清潔玻片，用記號筆劃上記號，左上角寫A字，右上角寫B(tài)字。2．用小滴管吸A型標準血清（抗B）一滴加入左側(cè)，用另一小滴管吸B型標準血清（抗A）一滴加入右側(cè)。3．穿刺手指取血，玻片的每側(cè)各放入一小滴血，用牙簽攪拌，使每側(cè)抗血清和血液混和。每邊用一支牙簽，切勿混用。4．靜置室溫下數(shù)分鐘后，在白色背景下肉眼觀察，也可顯微鏡觀察。注意事項：1、采血時要盡量避免用力擠壓手指或耳垂，以免發(fā)生溶血影響結(jié)果。2、如肉眼觀察難以辨認，可使用顯微鏡觀察凝血現(xiàn)象。操作流程（三）方法（細菌菌型測定）1.取一塊清潔載玻片，用記號筆劃上記號，在一側(cè)滴加標準的診斷血清一滴,另一側(cè)滴加一滴生理鹽水。2.用接種環(huán)無菌操作取適量的待測細菌,分別與標準診斷血清和生理鹽水混均。3.靜置室溫下數(shù)分鐘后，在白色背景下肉眼觀察，也可顯微鏡觀察。注意事項：（1）生理鹽水、診斷血清要適量；（2）待檢菌為腸道致病菌，注意無菌操作，玻片用后放入消毒缸內(nèi)；（3）用接種環(huán)取待檢菌時，不要挑取瓊脂；待檢菌與生理鹽水、診斷血清混勻時，不要涂得太寬，否則影響結(jié)果觀察。（四）結(jié)果判斷結(jié)果分析人類ABO血型抗原是根據(jù)紅細胞膜上有無特異性抗原（凝集原）A或B來劃分的血液類型系統(tǒng)，將血型分為A型、B型、AB型、O型四種。RBC膜抗原無血型ABABO抗A、抗B)無抗A抗B(血漿抗體

BAA和B二、沉淀反應（雙向瓊脂擴散試驗）

又稱雙向瓊脂擴散，是利用瓊脂凝膠作介質(zhì)的一種沉淀反應。瓊脂是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構，可使大分子物質(zhì)通過，分子的擴散作用使分別兩處的抗原抗體相遇，比例合適時形成沉淀，可觀察到沉淀線。沉淀線的特征與位置取決于抗原分子的大小、結(jié)構、擴散系數(shù)和濃度等。當抗原、抗體存在多種體系時，會出現(xiàn)多條沉淀線。因此可用來檢查抗原和免疫血清的特異性、純度或濃度比較抗原之間的異同點，因而應用范圍較廣。（一）實驗原理（二）材料玻片、瓊脂糖、抗原、抗體（0；1:2；1:4；1:8；1:16）、微量加樣器、滴管、濕盒、水浴箱等。（三）操作步驟1.制板：將溶化的1.5%瓊脂3.5-4ml倒在載玻片上，使之能將表面覆蓋，制成厚度約2～3mm厚的瓊脂糖凝膠板。2.打孔:待冷卻后根據(jù)所需形狀打孔,孔徑為4mm?？组g距離為4mm-5mm;瓊脂玻板的制備十字型打孔圖。3.加樣:用微量加樣器取Ag10uL加入中央孔;將抗體進行倍比稀釋,稀釋度分別為原液,1:2;1:4;每個稀釋度取10uL加入外圍抗體孔中。4.擴散:置濕盒37℃,24小時觀察結(jié)果每孔加入抗原/抗體10μl注意事項

（1）打孔時，不要將瓊脂劃破；（2）加樣時，不要溢出孔外；（3）加樣用的吸管不要混用。Ag01/11/21/41/81/16AbAbAbAbAb（四）結(jié)果記錄三、膠體金標記技術用膠體金顆粒標記已知抗體或抗原，檢測標本中未知抗原或抗體的技術。（一）原理以微孔濾膜為載體，包被已知抗原或抗體，加入待檢標本后，經(jīng)濾膜的毛細管作用使標本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過膠體金標記物的顯色（>20nm的膠體金顆粒呈磚紅色）達到檢測目的。根據(jù)檢測裝置的不同，可分為膠體金斑點滲濾試驗和膠體金斑點免疫層析試驗。膠體金斑點免疫層析試驗將各種反應試劑(抗體)附著在硝酸纖維素膜條上，檢測時將待檢標本加在膜條的一端，使膜條上的膠體金標記抗體溶解后，與標本中的待測物質(zhì)反應形成IC，并通過毛細管作用在膜條上滲濾、移行，再與膜上另一種抗體反應，再后被截留、聚集在膜條的一定區(qū)域，形成有顏色的反應條帶。臨床上常用的有膠體金早孕診斷試劑條用鼠抗α-HCG單克隆抗體和兔抗鼠1gG多克隆抗體分別固相硝酸纖維膜和膠體金標記的抗β-HCG單克隆抗體及其他試劑制成，應用層析式雙抗體夾心法的原理檢測尿液中HCG，用于妊娠早期輔助診斷。（二）材料待檢尿液、早早孕試驗條（三）方法將早早孕試驗棒的吸水區(qū)浸入待檢尿液中3~5秒，勿超過“max”線取出試驗條放置于干燥、不吸水的平面上，置4~5秒后觀察結(jié)果C區(qū)T區(qū)吸水區(qū)

抗小鼠IgG抗體(固定)抗α-HCG抗體(固定)膠體金-抗β

-HCG抗體(小鼠IgG,游離)下端浸入尿液試紙條HCG虹吸作用HCG上行與吸水區(qū)的金標抗體結(jié)合,并上行至T區(qū),HCG又與抗α-HCG抗體結(jié)合---雙抗體夾心法C區(qū)T區(qū)抗α-HCG+HCG+膠體金-抗β-HCGT區(qū)紅線C區(qū)紅線抗小鼠IgG+膠體金-抗β-HCG陽性陰性無效HCG(+)HCG(-)結(jié)論:（四）實驗結(jié)果(3種可能)（五）結(jié)果分析人