第四章蛋白質化學

第四章蛋白質化學

（ChemistryofProtein)2006-81第四章蛋白質化學導學掌握蛋白質的分子組成與結構熟悉蛋白質的理化；常用分離、純化技術的基本原理。了解蛋白質分子結構與功能的關系；蛋白質的分類以及重要的活性肽。2006-82第四章蛋白質化學教學內容

蛋白質的分子組成

蛋白質的分子結構

蛋白質的理化性質與分離純化蛋白質的分類2006-83第四章蛋白質化學第一節(jié)蛋白質的分子組成蛋白質含量=樣品所含氮量×6.25一、蛋白質元素組成：蛋白質的特征元素，平均含量：16%CHONS2006-84第四章蛋白質化學二、蛋白質的基本組成單位—氨基酸（一）氨基酸的結構α共同結構2006-85第四章蛋白質化學氨基酸結構特點：20種編碼氨基酸氨基酸的不同在于R側鏈不同均為L-α-氨基酸（甘氨酸、脯氨酸除外）2006-86第四章蛋白質化學（二）氨基酸的分類非極性中性氨基酸極性中性基氨基酸極性酸性氨基酸極性堿性氨基酸根據R基極性大小分：R基有極性，但不帶電，呈親水性R基無極性，呈疏水性R基有極性，電離后R基帶負電荷R基有極性，電離后R基帶正電荷2006-87第四章蛋白質化學非極性中性氨基酸NHCH32CH22006-88第四章蛋白質化學極性中性氨基酸Cys，2006-89第四章蛋白質化學酸性氨基酸2006-810第四章蛋白質化學堿性氨基酸H2N-C-NH—=NH2006-811第四章蛋白質化學（三）氨基酸的理化性質氨基酸具有氨基、羧基等能接受H+而成——NH3+具堿性能電離出H+而成——COO-具酸性兩性電離和等電點2006-812第四章蛋白質化學氨基酸的兩性電離pH<pIpH=pI（兼性離子）pH>pI等電點：氨基酸所帶正負電荷相等時溶液的pH（pI）值即該氨基酸的等電點2006-813第四章蛋白質化學2.茚三酮反應

（藍紫色）脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮反應生成黃色化合物2006-814第四章蛋白質化學三、肽

（一）肽的形成和命名

肽鍵的形成1.肽鍵2006-815第四章蛋白質化學肽鍵平面2006-816第四章蛋白質化學2.肽的形成與命名肽、寡肽(oligopeptide)、多肽(polypeptide)多肽鏈（polypeptidechain）主鏈骨架（backbone）側鏈部分（sidechain）羧基末端或C-末端（C-terminus）氨基末端或N-末端（N-terminus）2006-817第四章蛋白質化學多肽鏈的結構

側鏈N-末端C-末端主鏈骨架HOH2006-818第四章蛋白質化學（二）體內重要的肽

谷胱甘肽（GSH）的結構Glu-Cys-Gly功能基：-SH解毒劑、抗氧化劑2006-819第四章蛋白質化學第二節(jié)蛋白質的分子結構蛋白質的分子結構基本結構空間結構一級結構二級結構三級結構四級結構2006-820第四章蛋白質化學一、一級結構概念：多肽鏈中氨基酸的組成與排列順序主鍵：肽鍵意義：決定蛋白質的空間結構2006-821第四章蛋白質化學胰島素的一級結構A鏈B鏈2006-822第四章蛋白質化學二、二級結構（secondarystructure）定義蛋白質分子中由于肽鍵平面的相對旋轉，構成的局部空間構象。

2006-823第四章蛋白質化學（一）二級結構的類型α-螺旋β-折疊β-轉角無規(guī)則卷曲2006-824第四章蛋白質化學1.α-螺旋（α-helix）

右手螺旋

每周含3.6個殘基

螺距0.54nm

作用鍵：氫鍵0.50nm0.54nm氫鍵α-碳原子側鏈2006-825第四章蛋白質化學2.β-折疊

（β-sheet）鋸齒狀順向平行、逆向平行作用鍵：氫鍵平行俯視側視反平行俯視側視2006-826第四章蛋白質化學3.β-轉角（β-turn）2006-827第四章蛋白質化學4．無規(guī)卷曲（randomcoil）肽鏈的肽鍵平面不規(guī)則排列，形成松散的二級結構。2006-828第四章蛋白質化學（二）超二級結構與結構域

超二級結構（supersecondarystructure）二級結構單元進一步聚集和組合在一起——模序（motif）如αα、βαβ、βββ等

亮氨酸拉鏈和鋅指結構

2006-829第四章蛋白質化學（二）超二級結構與結構域結構域（domain）超二級結構的進一步組合、折疊形成的球狀區(qū)域。是蛋白質的功能部位2006-830第四章蛋白質化學免疫球蛋白結構域

重鏈輕鏈結構域2006-831第四章蛋白質化學三、三級結構

（tertiarystructure）定義：在二級結構基礎上，所有原子（主鏈+側鏈）相互作用形成的空間構象

2006-832第四章蛋白質化學三、三級結構

（tertiarystructure）化學鍵--氫鍵、疏水鍵、離子鍵、二硫鍵等次級鍵--親水基團：分子表面；疏水基團：分子內部2006-833第四章蛋白質化學三級結構示意圖二硫鍵極性基團離子鍵2006-834第四章蛋白質化學四、四級結構（quaternarystructre）定義：兩個或兩個以上獨立三級結構的多肽鏈通過次級鍵結合而形成的空間結構疏水鍵、氫鍵、鹽鍵亞基2006-835第四章蛋白質化學血紅蛋白四級結構示意圖4個亞基構成2α-亞基2β-亞基2006-836第四章蛋白質化學蛋白質一、二、三、四級結構示意圖2006-837第四章蛋白質化學五、維持蛋白質分子空間構象的主要化學鍵

氫鍵、疏水鍵、離子鍵、范德華力、二硫鍵等2006-838第四章蛋白質化學蛋白質分子中的主要次級鍵

離子鍵疏水鍵二硫鍵氫鍵范德華力2006-839第四章蛋白質化學六、蛋白質結構與功能的關系蛋白質的一級結構決定其高級結構蛋白質的空間構象決定蛋白質的生物學功能。2006-840第四章蛋白質化學（一）一級結構與功能的關系

某些蛋白質的一級結構加工后，才具有生物學活性。如胰島素原（proinsulin）的一級結構加工2006-841第四章蛋白質化學（一）一級結構與功能的關系一級結構的改變可引起某些疾病的發(fā)生由于蛋白質分子的變異或缺失而產生的疾病，稱為分子?。╩oleculardisease）。如鐮狀紅細胞性貧血2006-842第四章蛋白質化學（二）空間結構與功能的關系空間構象決定蛋白質功能構象改變，功能改變2006-843第四章蛋白質化學血紅蛋白結合氧前后構象的變化當血紅蛋白結合氧以后，α1β1與α2β2兩個二聚體彼此滑動15°，其構象由T（tense）型轉變?yōu)镽（relaxed）型。Hb(T態(tài))HbO2(R態(tài))α1β1α2β215o2006-844第四章蛋白質化學任何一個亞基接受氧分子后，會增進其它亞基吸附氧分子的能力環(huán)境氧濃度高時Hb快速吸收氧分子環(huán)境氧濃度低時Hb快速釋出氧分子動脈靜脈血紅蛋白對氧的運輸2006-845第四章蛋白質化學第三節(jié)蛋白質的理化性質與分離純化2006-846第四章蛋白質化學一、蛋白質的理化性質（一）蛋白質的一般性質

1.蛋白質的紫外吸收特征蛋白質（色氨酸、酪氨酸）（苯丙氨酸）

λ=280nmλ=260nm

紫外吸收（與蛋白質濃度成正比）2006-847第四章蛋白質化學蛋白質的紫外吸收10,000100010010

200250300波長（nm）TrpPheTyr摩爾吸光度（M-1cm-1）2006-848第四章蛋白質化學2.蛋白質的兩性電離和等電點與氨基酸的兩性電離、等電點相同2006-849第四章蛋白質化學雙縮脲反應：

Cu2+

蛋白質紫色絡合物

OH-3.蛋白質的呈色反應顏色反應→光吸收→定量分析2006-850第四章蛋白質化學3.蛋白質的呈色反應顏色反應→光吸收→定量分析酚試劑反應：

磷鎢酸蛋白質藍色化合物

磷鉬酸2006-851第四章蛋白質化學米倫試劑反應：

米倫試劑蛋白質紅色沉淀

△3.蛋白質的呈色反應顏色反應→光吸收→定量分析2006-852第四章蛋白質化學考馬斯亮藍反應：

考馬斯亮藍蛋白質（R-250）紅藍色

（G-250）藍綠色3.蛋白質的呈色反應顏色反應→光吸收→定量分析2006-853第四章蛋白質化學（二）蛋白質的高分子性質1.蛋白質的膠體性質蛋白質分子的直徑在膠體顆粒的范圍(1~100nm)蛋白質溶液是穩(wěn)定親水膠體溶液穩(wěn)定因素：水化膜、同種電荷2006-854第四章蛋白質化學堿堿酸酸

2006-855第四章蛋白質化學2.蛋白質的擴散與沉降蛋白質分子大，擴散速度慢沉降：通過超速離心克服布朗運動使蛋白質顆粒下沉的現象沉降系數（S）可粗略反映蛋白質分子大小2006-856第四章蛋白質化學3.蛋白質的變性與復性變性劑蛋白質空間構象破壞生物學活性喪失理化性質改變加熱、酸堿、有機溶劑、尿素、鹽酸胍、去污劑易水解易沉淀蛋白質非共價鍵和二硫鍵破壞，不涉及肽鍵2006-857第四章蛋白質化學復性：去除變性因素，蛋白質恢復空間構象與生物學活性的過程3.蛋白質的變性與復性2006-858第四章蛋白質化學核糖核酸酶的變性與復性示意圖8M尿素或β-巰基乙醇透析2006-859第四章蛋白質化學某些蛋白質在發(fā)生熱變性后，松散的多肽鏈相互纏繞在一起，變成固體狀態(tài)，稱為蛋白質的凝固（coagulation）。2006-860第四章蛋白質化學二、蛋白質的分離純化鑒定技術蛋白質在細胞內常與核酸、多糖、脂類及其它小分子物質結合在一起，需要對其進行分離、純化與鑒定。2006-861第四章蛋白質化學（一）離心原理：分子大小、密度不同→沉降速度不同分類：普通離心：3~10kr/min

高速離心：10~25kr/min

超速離心：＞25kr/min常用S值表示蛋白質分子質量相對大小2006-862第四章蛋白質化學（二）透析

(dialysis)用透析袋（半透膜）把大分子和小分子分開的方法2006-863第四章蛋白質化學（三）沉淀(precipitation)定義：蛋白質分子相互聚集從溶液中析出的現象原理：破壞同種電荷和水化膜2006-864第四章蛋白質化學蛋白質的沉淀示意圖2006-865第四章蛋白質化學（三）沉淀(precipitation)方法：

鹽析法

有機溶劑沉淀法

重金屬鹽沉淀法

生物堿試劑沉淀法2006-866第四章蛋白質化學1.鹽析（saltingout）法

定義：高濃度中性鹽使蛋白質從溶液中析出沉淀的方法原理：破壞水化膜、中和電荷特點：蛋白質不變性分段鹽析：不同濃度的中性鹽分離不同蛋白質2006-867第四章蛋白質化學2.有機溶劑沉淀蛋白質

原理：破壞水化膜條件：pH=pI特點：常在低溫下進行常用有機溶劑：乙醇、丙酮等2006-868第四章蛋白質化學3.重金屬鹽沉淀蛋白質原理：中和負電荷條件：pH＞pI特點：蛋白質變性2006-869第四章蛋白質化學4.生物堿試劑與某些酸類沉淀蛋白質原理：中和正電荷條件：pH＜pI特點：蛋白質變性常用酸類：苦味酸、鞣酸、鎢酸、三氯醋酸、硝酸、過氯酸等2006-870第四章蛋白質化學（四）蛋白質層析

（chromatography）定義：待分離的液體（流動相mobilephase）經過一個固態(tài)物質（固定相solidphase)后所發(fā)生的各組分在兩相中分布的變化。原理：根據混合物溶液中蛋白質分子的大小、形狀、極性、親和力等差異而加以分離。2006-871第四章蛋白質化學類型：離子交換層析（ionexchangechromatography）凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography)親和層析(affinitychromatography)（四）蛋白質層析（chromatography）2006-872第四章蛋白質化學離子交換層析凝膠過濾層析親和層析2006-873第四章蛋白質化學（五）電泳（electrophoresis）定義：帶電顆粒在電場中將向與自身電荷相反的電極移動，從而到達分離的方法。2006-874第四章蛋白質化學常用的電泳技術：瓊脂糖凝膠電泳（agarosegelelectrophoresis，AGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）等電聚焦電泳（isoelectricfocusing，IEF）雙向電泳（twodimensionalelectrophoresis，2DE）毛細管電泳（capillaryelectrophoresis，CE）（五）電泳（electrophoresis）2006-875第四章蛋白質化學（六）westernblotting（蛋白印跡法，免疫印跡法）

把電泳分離的蛋白組分轉移到固定膜（如硝酸纖維素膜、尼龍膜或PVDF膜）上的技術，稱為蛋白印跡（westernblotting）。

2006-876第四章蛋白質化學2006-877第四章蛋白質化學（七）蛋白質芯片將已知蛋白質固化于固體支持物上，利用蛋白質與蛋白質之間的相互作用，對未知蛋白質進行檢測的方法。2006-878第四章蛋白質化學2006-879第四章蛋白質化學第四節(jié)蛋白質的分類根