仿制藥雜質(zhì)檢查方法建立和方法學(xué)研究與評(píng)價(jià)

仿制藥雜質(zhì)檢查方法建立和方法學(xué)研究與評(píng)價(jià)1主要內(nèi)容一、概述二、雜質(zhì)檢查方法的建立三、雜質(zhì)檢查方法學(xué)驗(yàn)證的要求四、雜質(zhì)檢查方法和方法驗(yàn)證常見(jiàn)問(wèn)題分析2一、概述1、雜質(zhì)檢查方法和方法驗(yàn)證對(duì)仿制藥的重要意義（1）安全性的重要保證－－關(guān)注毒性雜質(zhì)（2）評(píng)價(jià)仿制藥是否一致的關(guān)鍵指標(biāo)之一－－仿制藥與被仿制藥的質(zhì)量一致－－雜質(zhì)的種類和數(shù)量不高于被仿制藥（3）雜質(zhì)研究的基礎(chǔ)－－雜質(zhì)檢查方法不合適或方法學(xué)驗(yàn)證不完善，雜質(zhì)檢查不可靠，無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量3仿制藥與被仿制藥一致性要求藥學(xué)方面一致（含量、結(jié)構(gòu)、雜質(zhì)、其他檢查項(xiàng)等）雜質(zhì)的數(shù)量和種類低于被仿制藥，否則需要分析雜質(zhì)的安全性并提供有關(guān)數(shù)據(jù)，必要時(shí)應(yīng)進(jìn)行相關(guān)的安全性試驗(yàn)建立雜質(zhì)適宜的雜質(zhì)檢查方法用于判斷一致性用語(yǔ)工藝優(yōu)化、去除雜質(zhì)、考察穩(wěn)定性、控制藥物質(zhì)量一、概述42、目前國(guó)內(nèi)仿制藥研究中雜質(zhì)檢查面臨的困難－－雜質(zhì)來(lái)源不清：被仿制藥和仿制藥雜質(zhì)的種類和數(shù)量不清，包括雜質(zhì)產(chǎn)生和引入的過(guò)程、降解途徑－－雜質(zhì)甲醇方法缺乏針對(duì)性：不知控制何種雜質(zhì)以及為何控制，缺乏安全性數(shù)據(jù)的支持－－雜質(zhì)對(duì)照品制備困難（受限于工藝?yán)щy）：方法驗(yàn)證不充分－－雜質(zhì)檢查結(jié)果難于評(píng)價(jià)：以及基礎(chǔ)薄弱，需要提高雜質(zhì)研究水平，包括雜質(zhì)檢查方法和驗(yàn)證水平，以體改仿制藥研制水平一、概述5例鹽酸曲美他嗪片－－進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)采用梯度洗脫，對(duì)3種已知雜質(zhì)、單個(gè)未知雜質(zhì)及總雜質(zhì)分別進(jìn)行控制－－國(guó)內(nèi)仿制采用等度洗脫，僅對(duì)未知雜質(zhì)（單個(gè)雜質(zhì)和/或總雜質(zhì)進(jìn)行控制）－－國(guó)內(nèi)同品種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)有關(guān)物質(zhì)的規(guī)定：總雜質(zhì)不得過(guò)1.0％一、概述63、主要的技術(shù)指導(dǎo)原則和技術(shù)要求《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》《已有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品研究技術(shù)指導(dǎo)原則》過(guò)渡期品種集中審評(píng)（化學(xué)藥品）技術(shù)要求FDDA、ICH的相關(guān)指導(dǎo)原則－GuidancesforIndustryANDAs:ImpuritiesinDrugsSubstancesChemistry、Manufacturing、ControlesInformation－ANDAs:ImpuritiesinDrugsProductsQ3A(R)Q3B(R)一、概述74、雜質(zhì)的范圍有機(jī)雜質(zhì)－－包括工藝中引入的雜質(zhì)和降解產(chǎn)物，化學(xué)結(jié)構(gòu)與活性成分的分子式類似或具淵源關(guān)系，通常稱有關(guān)物質(zhì)無(wú)機(jī)雜質(zhì)－－產(chǎn)生的無(wú)機(jī)物殘留溶劑－－生產(chǎn)過(guò)程中使用的有機(jī)溶劑

來(lái)源－－工藝雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、從反應(yīng)物及試劑中混入的雜質(zhì)（外源性雜質(zhì)）等結(jié)構(gòu)雜質(zhì)－－幾何異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體、聚合物、其它甾體、其它氨基酸一、概述8二、雜質(zhì)檢查方法的建立目的1、建立雜質(zhì)檢查方法是質(zhì)控的要求－－包括具體的分析操作方法，以及計(jì)算方法、限度要求2、用語(yǔ)分析雜質(zhì)譜－－考察與被仿制藥一致性，進(jìn)而優(yōu)化制備工藝及穩(wěn)定性考察91、雜質(zhì)檢查方法建立的前提－（1）被仿制藥雜質(zhì)譜如何：參考公開(kāi)信息：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、說(shuō)明書、有關(guān)文獻(xiàn)和專利－（2）自身雜質(zhì)如何？理論綜合分析（合成路線、反應(yīng)條件、處方工藝、輔料等）、直接測(cè)試用于未知雜質(zhì)或未定性雜質(zhì)的“標(biāo)記”方法－LC-MS/GC-MS或CE-MS法－HPLC峰保留時(shí)間對(duì)比法－其它方法二、雜質(zhì)檢查方法的建立102、仿制藥雜質(zhì)檢查方法建立的一般考慮點(diǎn)（1）參考被仿制藥的方法：A、被仿制藥雜質(zhì)檢查方法和限度如何？標(biāo)準(zhǔn)中控制了哪些雜質(zhì)？B、重要參考，為方法建立提供重要的信息，全面考察C、不可簡(jiǎn)單套用－工藝或處方的不同，二者的雜質(zhì)譜可能不同，被仿制藥雜質(zhì)加查方法可能不適－被仿制藥標(biāo)準(zhǔn)較低，無(wú)雜質(zhì)檢查項(xiàng)或較為簡(jiǎn)單－被仿制藥的雜質(zhì)檢查方法無(wú)法獲得二、雜質(zhì)檢查方法的建立112、仿制藥雜質(zhì)檢查方法建立的一般考慮點(diǎn)（2）結(jié)合雜質(zhì)的理化特點(diǎn)：根據(jù)雜質(zhì)譜，考慮雜質(zhì)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)例如：阿司匹林→比色法→游離水楊酸（CP2005）葡萄糖注射液→UV法→5-羥甲基糠醛（CP2005）氨基酸原料藥→TLC法→其它氨基酸（CP2005）二、雜質(zhì)檢查方法的建立122、仿制藥雜質(zhì)檢查方法建立的一般考慮點(diǎn)（3）結(jié)合雜質(zhì)的毒性特點(diǎn)：安全性控制的需要被仿制藥和自身雜質(zhì)的毒性如何？重視藥理毒理及臨床安全性研究結(jié)果的作用對(duì)于有些分子通過(guò)以下化學(xué)反應(yīng)可能產(chǎn)生潛在的遺傳毒性作用－烷基化－交聯(lián)－脫嘌呤可參考遺傳毒性庫(kù)遺傳毒性雜質(zhì)或具有可能引起遺傳毒性的結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)需要建立靈敏的試驗(yàn)方法－EMEA《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》：毒理學(xué)擔(dān)憂閾值（TLC)1.5mg/人/日二、雜質(zhì)檢查方法的建立132、仿制藥雜質(zhì)檢查方法建立的一般考慮點(diǎn)（4）考慮不同檢查方法的特點(diǎn)：主要是靈敏度和專屬性能否符合要求痕量雜質(zhì)和遺傳毒性雜質(zhì)的嚴(yán)格控制，對(duì)方法要求較高－化學(xué)法＆TLC法＆HPLC法－HPLC/MS，HPLC/熒光CE法可用于微量樣品GC適用于揮發(fā)性雜質(zhì)檢查二、雜質(zhì)檢查方法的建立142、仿制藥雜質(zhì)檢查方法建立的一般考慮點(diǎn)（5）注意多種方法聯(lián)用：由雜質(zhì)多樣性復(fù)雜性和方法局限性所決定單一方法不能滿足多個(gè)雜質(zhì)的檢測(cè)時(shí)，可采用兩種以上的方法互為補(bǔ)充，控制雜質(zhì)－化學(xué)法＆色譜法＆光譜法＆生物檢定法－同一方法采用不同測(cè)試條件如正相HPLC、反相HPLC、不同流動(dòng)相的反相HPLC等－分離技術(shù)于檢測(cè)手段聯(lián)用，較為有效，如HPLC、GC、LC-MS、GC-MS、HPLC-PDA、CE等二、雜質(zhì)檢查方法的建立152、仿制藥雜質(zhì)檢查方法建立的一般考慮點(diǎn)（6）綜合藥學(xué)的其他研究結(jié)果：雜質(zhì)檢查與藥物外觀色澤、含量等項(xiàng)目間存在密切聯(lián)系，如果這些項(xiàng)目發(fā)生明顯變化，而雜質(zhì)基本不變時(shí)，應(yīng)分析原因，關(guān)注雜質(zhì)檢查方法的可行性。二、雜質(zhì)檢查方法的建立163、雜質(zhì)檢查常見(jiàn)方法介紹HPLC法－考慮被仿制藥的色譜條件－考察同類物質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)檢查方法－一般選擇多種色譜條件：正相和反相－方法包括：固定相、流動(dòng)相、洗脫方式、波長(zhǎng)、測(cè)試樣品的處理、具體操作、計(jì)算方法二、雜質(zhì)檢查方法的建立173、雜質(zhì)檢查常見(jiàn)方法介紹（1）固定相的選擇－根據(jù)特征研究的藥物的特性選擇合適填料的柱子。常用RP-HPLC，色譜柱多選C18柱、C8柱、苯基柱、氨基柱也有使用－C18柱時(shí)，流動(dòng)相有機(jī)溶劑％通?！?％－流動(dòng)相的pH值2～8－pH>8，溶解硅膠載體，宜選用耐堿填充劑，包覆聚合物、高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、非硅膠或有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化填充劑－pH<2，鍵合相水解脫落，宜選用耐酸性填充劑：有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化填充劑、具有大體積側(cè)鏈的二異丙基或二異丁基取代C18鍵合硅膠等二、雜質(zhì)檢查方法的建立183、雜質(zhì)檢查常見(jiàn)方法介紹（1）固定相的選擇－注意不同品牌柱子在耐用性方面的研究：a、當(dāng)雜質(zhì)峰與主峰的分離情況不十分完美b、確定輔料峰的相對(duì)保留時(shí)間（用于定位扣除輔料的干擾）c、確定特定雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間d、確定有關(guān)物質(zhì)出峰完畢的保留時(shí)間－－當(dāng)不同品牌而引起以上各因素不固定時(shí)，應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)中注明品牌二、雜質(zhì)檢查方法的建立193、雜質(zhì)檢查常見(jiàn)方法介紹（2）流動(dòng)相的選擇嘗試多種流動(dòng)相結(jié)合雜質(zhì)的性質(zhì)－手性雜質(zhì)－無(wú)紫外吸收雜質(zhì)－一般雜質(zhì)（3）洗脫方式的選擇等度洗脫梯度洗脫極性大的化合物可能被掩蓋，極性小的化合物難以被洗脫，甚至保留在柱上，可使用梯度洗脫法二、雜質(zhì)檢查方法的建立203、雜質(zhì)檢查常見(jiàn)方法介紹（4）波長(zhǎng)的選擇－選擇的原則是大部分主要雜質(zhì)與主成分均在此波長(zhǎng)下有吸收：二極管陣列法－無(wú)紫外吸收或檢測(cè)波長(zhǎng)處吸收相差較大的多種化合物，有時(shí)在單一檢測(cè)波長(zhǎng)處不能檢出－兼顧各雜質(zhì)吸收情況：特定波長(zhǎng)檢測(cè)特定雜質(zhì)－必要時(shí)，該用其它類型的檢測(cè)器二、雜質(zhì)檢查方法的建立213、雜質(zhì)檢查常見(jiàn)方法介紹（5）樣品的處理和配制－預(yù)處理樣品考慮乳膏提取可能導(dǎo)致的雜質(zhì)漏檢和失真衍生化處理導(dǎo)致雜質(zhì)丟失－樣品濃度的影響濃度高利于雜質(zhì)檢出，但防超載低濃度樣品雜質(zhì)的檢查難題？二、雜質(zhì)檢查方法的建立223、雜質(zhì)檢查常見(jiàn)方法介紹（6）雜質(zhì)的定量計(jì)算方法－雜質(zhì)對(duì)照品法：定量準(zhǔn)確，已知雜質(zhì)，需用雜質(zhì)對(duì)照品－校正因子的主成分自身對(duì)照法：定量準(zhǔn)確，已知雜質(zhì)，無(wú)需長(zhǎng)期提供雜質(zhì)對(duì)照品－不加校正因子的主成分自身對(duì)照法：前提是假定雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子基本相同，有一定的誤差，可用于未知雜質(zhì)，已知雜質(zhì)對(duì)主成分的響應(yīng)因子在0.9～1.1之間－峰面積歸一化法：簡(jiǎn)便，因雜質(zhì)與主成分響應(yīng)因子不同，線性范圍不同、儀器對(duì)他們的積分精度及準(zhǔn)確度不同等因素，有一定的局限性二、雜質(zhì)檢查方法的建立23目前定量方法中存在的主要問(wèn)題－雜質(zhì)對(duì)照品法：使用較少－主成分自身對(duì)照法：較少采用校正因子計(jì)算（雜質(zhì)無(wú)法進(jìn)行歸屬或雜質(zhì)對(duì)照品無(wú)法得到，校正因子無(wú)法計(jì)算）－常見(jiàn)的是對(duì)未知雜質(zhì)，不加校正因子的主成分自身對(duì)照或面積歸一化法（無(wú)法準(zhǔn)確定量，無(wú)法有效檢測(cè)雜質(zhì)）TLC法－設(shè)備和操作簡(jiǎn)便，一些特定雜質(zhì)的檢查－靈敏度較差、定量不夠精確，分離度欠佳，有時(shí)無(wú)法滿足需要－僅限于限度檢查（半定量），結(jié)合不同原理的檢視技術(shù)能使各雜質(zhì)斑點(diǎn)均可顯示，彌補(bǔ)HPLC的不足。－需做好系統(tǒng)實(shí)用性試驗(yàn)二、雜質(zhì)檢查方法的建立24定量方法－限度檢查（半定量）－對(duì)照品比較法：已知雜質(zhì)，對(duì)照品－自身對(duì)照法：已知雜質(zhì)、未知雜質(zhì)、色調(diào)一致－檢視技術(shù)：顯色、熒光、自身顏色LC-MS、GC-MS、GC-IR、CE-MS法－分離技術(shù)和鑒別技術(shù)聯(lián)用，為解析化合物的結(jié)構(gòu)提供直接證據(jù)－有助于雜質(zhì)譜的分析和定性二、雜質(zhì)檢查方法的建立25三、雜質(zhì)檢查方法學(xué)驗(yàn)證的要求方法驗(yàn)證的目的考察分析方法十分適用于雜質(zhì)的檢測(cè)和定量方法驗(yàn)證中面臨的困難雜質(zhì)譜不清雜質(zhì)對(duì)照品無(wú)法獲取驗(yàn)證的具體要求261、專屬性－指在可能的共存主分存在時(shí)，對(duì)被分析無(wú)物準(zhǔn)確測(cè)定的能力－分離度：專屬性指標(biāo)、雜質(zhì)譜的明確是基礎(chǔ)－雜質(zhì)可得→最難物質(zhì)分離對(duì)得分離試驗(yàn)、粗品中間體分離試驗(yàn)、輔料與雜質(zhì)及主成分得分離試驗(yàn)－雜質(zhì)不可得→強(qiáng)制降解試驗(yàn)、與另一成熟方法比對(duì)峰純度→二極管陣列、質(zhì)譜；改變流動(dòng)相的比例方法不夠?qū)贂r(shí)，應(yīng)多個(gè)方法予以補(bǔ)充三、雜質(zhì)檢查方法驗(yàn)證的要求27降解試驗(yàn)的注意點(diǎn)－－降解程度－－當(dāng)降解產(chǎn)物、中間體、副產(chǎn)物吸收波長(zhǎng)不同時(shí)的處理－－制劑降解破壞－－消除輔料的干擾，當(dāng)無(wú)法避開(kāi)輔料的干擾時(shí)應(yīng)對(duì)輔料進(jìn)行定于予以扣除三、雜質(zhì)檢查方法驗(yàn)證的要求28破壞性試驗(yàn)－－酸降解：一般采用0.1mol/L～1mol/L的鹽酸或硫酸－－堿降解：一般采用0.1mol/L～1mol/L的氫氧化鈉溶液－－氧化降解采用合適的過(guò)氧化氫溶液－－必要時(shí)可以加熱或提高濃度－－對(duì)高溫試驗(yàn)通常溫度高于加速試驗(yàn)溫度的10℃，如50℃、60℃－－對(duì)于原料藥有需要考慮水溶液或混懸液的降解－－考慮在不同pH值條件下的降解－－光照試驗(yàn)可采用4500Lx三、雜質(zhì)檢查方法驗(yàn)證的要求29存在的主要問(wèn)題（1）主藥完全降解，無(wú)法對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)（2）由于選擇降解條件強(qiáng)度不夠，使藥物未能降解，而誤以為藥物穩(wěn)定（3）不能選擇合適的測(cè)定方法測(cè)定降解產(chǎn)物，使主成分降解后測(cè)定的回收量偏低（4）未考慮破壞性試驗(yàn)時(shí)產(chǎn)生的聚合物三、雜質(zhì)檢查方法驗(yàn)證的要求302、靈敏度－試樣中能被檢測(cè)（或定量）的最低量－通常用檢測(cè)限及定量限表征，可根據(jù)直觀評(píng)價(jià)、信噪比、響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)差和斜率獲得。－應(yīng)滿足質(zhì)控需要－信噪比的方法3、精密度－在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻樣品經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。－重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性三、雜質(zhì)檢查方法驗(yàn)證的要求314、準(zhǔn)確度－測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近程度－已知雜質(zhì)：回收率（根據(jù)精密度、專屬性、線性）推斷－未知雜質(zhì)：與另一成熟方法比對(duì)、根據(jù)質(zhì)量平衡原理結(jié)合含量等結(jié)果進(jìn)行粗略判定，必要時(shí)研究幾種不同色譜條件甚至不同測(cè)定原理的方法進(jìn)行比較選用5、線性－在設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，檢測(cè)響應(yīng)值與待測(cè)物質(zhì)量之間成正比例關(guān)系的程度三、雜質(zhì)檢查方法驗(yàn)證的要求326、范圍－檢測(cè)方法能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性的高、低濃度或量的區(qū)間－范圍應(yīng)在規(guī)定限度的±20％間或定量限至限度的+20％間，若含量測(cè)定和雜質(zhì)檢查同用一套色譜系統(tǒng)，則線性范圍應(yīng)為雜質(zhì)限度的-20％至含量限度（上限）的+20％7、耐用性－指測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度－HPLC：流動(dòng)相的組成比例及pH值、不同廠家或批號(hào)的色譜柱、柱效、柱溫、流速等及被測(cè)溶液的穩(wěn)定性、樣品提取的次數(shù)和時(shí)間等建議固定上述測(cè)定條件的參數(shù)，如柱長(zhǎng)、填料的粒度、溫度、流速，甚至品牌三、雜質(zhì)檢查方法驗(yàn)證的要求337、耐用性－－TLC：適當(dāng)改變展開(kāi)劑比例及pH值，考察耐用性。如對(duì)色譜條件苛刻時(shí)，規(guī)定最難分離物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)。－－較容易忽略8、溶液的穩(wěn)定性考察－－一般在常溫、常光情況下進(jìn)行，對(duì)同一份樣品溶液進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的測(cè)定，以雜質(zhì)量的變化進(jìn)行考察－－光或溫度引起應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)中說(shuō)明避光或試驗(yàn)溫度9、系統(tǒng)適用性－－理論板數(shù)、柱拖尾因子、難分離物質(zhì)對(duì)的分離、對(duì)照溶液重復(fù)進(jìn)樣的偏差－－否則，應(yīng)對(duì)色譜系統(tǒng)作必要的調(diào)整或更換色譜柱三、雜質(zhì)檢查方法驗(yàn)證的要求34四、雜質(zhì)檢查方法和方法驗(yàn)證常見(jiàn)問(wèn)題分析1、簡(jiǎn)單套用被仿制藥的檢查方法，未建立針對(duì)性的方法例：鹽酸偽麻黃堿，分別采用人工合成與植物提取工藝，有機(jī)溶劑殘留量、有關(guān)物質(zhì)均不同2、方法學(xué)驗(yàn)證不充分－強(qiáng)制降解條件過(guò)于劇烈，無(wú)法判斷主峰與降解產(chǎn)物的分離情況－樣品經(jīng)降解、氧化破壞后主藥被完全破壞，無(wú)法說(shuō)明其降解物與主峰的分離情況－調(diào)整降解條件的劇烈程度3、檢查方法對(duì)雜質(zhì)的控制不全面，尤其是對(duì)毒性雜質(zhì)35四、雜質(zhì)檢查方法和方法驗(yàn)證常見(jiàn)問(wèn)題分析建議的質(zhì)量保證策略過(guò)程控制：控制合成原料的純度終產(chǎn)品控制：檢查終產(chǎn)品殘留的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體4、方法靈敏度不夠eg:有關(guān)物質(zhì)檢查法的定量限未0.75ng，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定雜質(zhì)限度不得過(guò)1.0％，折算為0.5ng，表明此方法不能有效檢測(cè)產(chǎn)品的雜質(zhì)，需重新建立有效的雜質(zhì)檢測(cè)方法36四、雜質(zhì)檢查方法和方法驗(yàn)證常見(jiàn)問(wèn)題分析5、方法缺乏互補(bǔ)性eg：（1）合成重要中間體在選定的檢測(cè)波長(zhǎng)處物吸收，建立的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法無(wú)法檢測(cè)該物質(zhì)（2）建立該中間體適宜的檢測(cè)方法6、積分時(shí)間不充分，不能有效檢測(cè)雜質(zhì)－－氧化破壞試驗(yàn)中，主峰保留時(shí)間的3倍處，仍有降解峰出現(xiàn)，色譜圖記錄至2倍，不能有效檢測(cè)出有關(guān)物質(zhì)7、檢測(cè)波長(zhǎng)缺乏針對(duì)性－－220nm附近的吸收強(qiáng)度遠(yuǎn)高于278nm波長(zhǎng)處－－提供檢測(cè)波長(zhǎng)選擇的依據(jù)37四、雜質(zhì)檢查方法和方法驗(yàn)證常見(jiàn)問(wèn)題分析8、供試液制備處理欠妥e