第九章 生物芯片及數(shù)據(jù)分析技術(shù)

第九章生物芯片及數(shù)據(jù)分析技術(shù)在20世紀(jì)科技史時有兩件事是值得大書特書的：

（1）微電子芯片，它是計算機(jī)和許多家電的心臟，它改變了我們的經(jīng)濟(jì)和文化生活，并已進(jìn)入到每個家庭；

（2）DNA芯片，它將改變生命科學(xué)的研究方式，革新醫(yī)學(xué)診斷和治療，極大地提高人口素質(zhì)和健康水平。

——美國《財富》雜志人類基因組計劃人類基因組計劃（humangenomeproject,HGP）是一項(xiàng)國際性科學(xué)研究計劃，旨在闡明人類基因組30億個堿基對的序列，從物理和功能角度發(fā)現(xiàn)和定位人類基因組基因，破譯人類全遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面地認(rèn)識自我。對人類基因組的研究推動了整個生命科學(xué)的發(fā)展，同時也形成一門嶄新的科學(xué)——基因組學(xué)（genomics），即研究基因組的科學(xué)。上世紀(jì)70年代，美國投入巨資的“腫瘤計劃”擱淺，人們漸漸認(rèn)識到，包括癌癥在內(nèi)的各種人類疾病都與基因直接或間接相關(guān)。1984年，美國能源部（DOE）首次探討人類基因組DNA進(jìn)行全序列分析的前景1986年美國生物學(xué)家、諾貝爾獎獲得者杜爾貝科(R.Dulbecco)在《science》發(fā)表《癌癥研究的轉(zhuǎn)折點(diǎn)——測定人類基因組序列》（“人類基因組計劃的標(biāo)書”）得到熱烈響應(yīng)。1990年10月1日，人類基因組計劃正式啟動。2001年2月，人類基因組序列“工作框架圖”公布2006年5月，最后一條染色體序列被公布2008年1月，個人基因組計劃啟動人類基因組計劃主要研究內(nèi)容以具有遺傳多態(tài)性的遺傳標(biāo)記為位標(biāo)、以遺傳學(xué)距離為圖距的基因組圖。遺傳學(xué)距離以厘摩（centi-Morgan,cM）表示。連鎖的遺傳標(biāo)志之間的重組頻率為1%時，它們的相對距離為1cM，相當(dāng)于106bp(1Mb)。

遺傳多態(tài)性標(biāo)記為：RFLP、MS/STR、SNP。以一段已知核苷酸序列的DNA片段（稱為序列標(biāo)簽位點(diǎn)，sequencetaggedsite，STS）為位標(biāo)，對構(gòu)成基因組的DNA分子進(jìn)行測定，從而對某段DNA序列在染色體上的相對位置做一線性排列。以kb或Mb作為圖距而繪制的基因組圖。核苷酸序列圖即最詳盡的物理圖。通過測序得到基因組的序列，是一般意義上的人類基因組計劃。

GeneBank數(shù)據(jù)的快速增長人類基因組計劃催生了大量生物數(shù)據(jù)怎樣去研究如此眾多基因的生物信息及其在生命過程中所擔(dān)負(fù)的功能，成了全世界生命科學(xué)工作者共同的課題！傳統(tǒng)核酸印跡雜交的局限性傳統(tǒng)核酸印跡雜交：SouthernBlotting和NorthernBlotting等技術(shù)復(fù)雜、自動化程度低、檢測目的分子數(shù)量少、低通量(lowthrough-put)等對核酸序列分析與測定提出的新要求速度快、效率高高通量（可同時對大量核酸序列進(jìn)行檢測和分析）操作簡便、自動化程度更高成本低生物芯片技術(shù)正是在這樣的背景下應(yīng)運(yùn)而生。生物芯片技術(shù)定義：是采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子、糖類甚至組織切片和細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、濾膜等載體）的表面，組成高度密集的二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣本中的靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。原理：分子間特異性相互作用核酸雜交抗原－抗體作用DNA－蛋白質(zhì)間的識別作用等特點(diǎn)：高通量（一張芯片同時可分析千上萬的分子）

微型化（可裝入口袋）

自動化（技術(shù)自動化；結(jié)果分析自動化）

低成本（相對于同時進(jìn)行大量分子研究而言）

防污染分類：生物芯片DNA芯片（基因芯片）蛋白質(zhì)芯片組織芯片細(xì)胞芯片微陣列芯片芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab-on-a-chip）：生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)?！焉?、化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、生物化學(xué)反應(yīng)、分離檢測等基本操作單位集成或基本集成于一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學(xué)反應(yīng)過程，并對其產(chǎn)物進(jìn)行分析的一種技術(shù)。

生物芯片技術(shù)流程第一節(jié)DNA芯片（DNAchip）又稱為基因芯片（Genechip）或DNA微陣列（DNAMicroarray）。將大量已知的探針（寡核苷酸片段或DNA片段）固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品DNA按堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行雜交（探針能夠在基因混合物中識別出特定基因），最后通過檢測雜交信號的強(qiáng)度及分布來對特定基因進(jìn)行分析?；经h(huán)節(jié)：芯片制作樣品制備分子雜交檢測分析DNA芯片實(shí)驗(yàn)流程

DNA芯片制作就是根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?，將設(shè)計好的檢測探針通過一定的方法固定到固相支持物上。

主要有兩種：原位合成法和直接點(diǎn)樣法原位合成法和直接點(diǎn)樣法的比較DNA芯片的基本構(gòu)造1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜2.探針：高密度的探針序列按照一定的次序固定在支持物上，每個位點(diǎn)的序列是已知的外觀探針支持物剖面圖平面局部放大DNAmicroarraysonglassslides樣品制備（DNA、mRNA）——與一般的核酸提取比較類似，只不過為了降低污染和提高檢測靈敏度增加了純化、擴(kuò)增（PCR）和標(biāo)記。生物素常用標(biāo)記物：熒光素待測樣品（用Cy3-dUTP標(biāo)記）

對照樣品（Cy5-dUTP）

以表達(dá)譜芯片為例：

提取樣本組織細(xì)胞中的mRNA（樣本要新鮮并有代表性）

對提取的mRNA進(jìn)行純化

逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（可進(jìn)行PCR以提高靈敏度）

以雙鏈cDNA為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄（熒光標(biāo)記在此滲入）分子雜交——是已標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行反應(yīng)后產(chǎn)生一系列信息的過程。與傳統(tǒng)的核酸分子雜交相同，但要求更高：選擇合適的反應(yīng)條件、減少生物分子之間的錯配率。

考慮雜交反應(yīng)體系中鹽濃度、探針GC含量和所帶電荷、探針與芯片之間連接臂的長度及種類、檢測基因的二級結(jié)構(gòu)的影響。

利用生物素標(biāo)記的，在此染色（常用抗生蛋白鏈菌素-藻藍(lán)蛋白）檢測分析——利用專門的芯片掃描儀對雜交結(jié)果進(jìn)行圖象采集和分析。

熒光標(biāo)記陽性雜交圖基因芯片檢測結(jié)果不同的顏色代表一個探針點(diǎn)雜交上的帶熒光標(biāo)記的核酸分子數(shù)的差異。紅〉黃〉綠〉蘭〉紫DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用DNA測序：雜交測序（SBH）疾病診斷：尋找和檢測與疾病相關(guān)的基因及在RNA水平上檢測致病基因的表達(dá)用藥個體化分析：藥物篩選：基因表達(dá)研究：利用DNA芯片進(jìn)行雜交測序的原理雜交測序技術(shù)（SBH）可大規(guī)模地檢測和分析DNA的變異及多態(tài)性。突變疾病診斷1、用于診斷遺傳性疾病例：上海聯(lián)合基因公司開發(fā)了β-地中海性貧血的檢測芯片2、用于病原體的檢出和確定例：西安聯(lián)爾公司開發(fā)了呼吸道病原體診斷芯片，可檢出多種引起呼吸道感染的病原體。3、腫瘤的基因診斷

例：Affymetrix公司，把P53基因全長序列和已知突變的探針集成在芯片上，制成P53基因芯片，將在癌癥早期診斷中發(fā)揮作用。藥物篩選利用DNA芯片技術(shù)可比較正常組織（細(xì)胞）與病變組織（細(xì)胞）中大量相關(guān)基因表達(dá)的變化，從而發(fā)現(xiàn)一組疾病相關(guān)基因作為藥物篩選靶標(biāo)。應(yīng)用DNA芯片還可直接篩選特定的基因文庫以尋找藥物作用的靶點(diǎn)。表達(dá)譜芯片是DNA芯片中最常用的一種芯片。Affymetrix基因表達(dá)譜芯片的實(shí)驗(yàn)流程

生物信息學(xué)分析——基因芯片讀數(shù)實(shí)際上是掃描后的信號強(qiáng)度，是一種相對值。不同芯片之間要經(jīng)過以看家基因作為對照的標(biāo)準(zhǔn)化處理才有可比性。常用GAPDH或β-actin基因歸一化的數(shù)據(jù)1、差異基因的篩選倍數(shù)差異FoldChange=SignalA/SignalB（即待比較的兩個標(biāo)準(zhǔn)化以后的信號相除所得的值）

——常用標(biāo)準(zhǔn)Ratio（0.5，2.0）顯著性差異p值：進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)t檢驗(yàn)，p<0.05為顯著性差異，p<0.01為強(qiáng)顯著性差異

——生物學(xué)重復(fù)不少于3個每個探針點(diǎn)的Flag值/Call值：表達(dá)譜芯片中常用A、P、M來表示該探針點(diǎn)信號與背景信號的差異

——A-Absent：無顯著性差異

P-Present：有顯著性差異

M-Marginal：差異介于A和P之間

——要求比較的兩組，至少有一組內(nèi)不出現(xiàn)A火山圖（Volcanoplot）散點(diǎn)圖（Scatterplot）視圖分析

聚類分析將基因與最相關(guān)的表達(dá)譜放在一起，分析的基礎(chǔ)是總基因組的線性相關(guān)。生物系統(tǒng)的有序性質(zhì)可以保證聚類分析方法會揭示出生物行為的有趣特征。GO（GeneOntology）分析

——尋找不同樣品的差異基因可能和哪些基因功能的改變有關(guān)。分類：分子功能（MolecularFunction）生物過程（biologicalprocess）細(xì)胞組成（cellularcomponent）常用數(shù)據(jù)庫：

DAVID、GATHER、PANTHER等

表健脾益氣法相關(guān)差異基因GO分類（DAVID6.7）KEGGpathway分析

常用數(shù)據(jù)庫：

DAVID、BIORAG（BioResourceforArrayGenes）等

——包括圖解的細(xì)胞生化過程如代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號傳遞、細(xì)胞周期，及同系保守的子通路等信息

深入分析：涉及Gq蛋白激活的花生四烯酸-HETEs代謝通路表健脾益氣法相關(guān)差異基因信號通路分析（DAVID6.7）蛋白分子相互作用分析

常用數(shù)據(jù)庫：

STRING、pSTIING等String9.05在線分析pSTIING在線分析單基因分析

常用數(shù)據(jù)庫：

美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）歐洲生物信息研究所（EBI）蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片（Prochip）

——與DNA芯片比較類似，只不過蛋白質(zhì)芯片利用的是抗原/抗體、配基/配體（或受體）等蛋白質(zhì)之間的相互作用。蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片與DNA芯片的差異：檢測方法基本相同

應(yīng)用方向不同制備時的配基不同、固定條件不同

點(diǎn)樣密度不同結(jié)合反應(yīng)的原理不同

根據(jù)研究目的不同，蛋白芯片的探針可選用某些特定的抗原、抗體、酶和受體等。探針的標(biāo)記主要有：酶標(biāo)記（如辣根過氧化物酶HRP、堿性磷酸酶AP）熒光標(biāo)記（常用Cy3和Cy5）化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記（如吖啶酯）等蛋白質(zhì)芯片探針及其標(biāo)記

分子間的反應(yīng)主要有：①抗原抗體反應(yīng)②蛋白質(zhì)分子與其它蛋白分子或與核酸分子之間的特異性識別結(jié)合③酶與底物的識別等通過優(yōu)化合適的反應(yīng)條件使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中，可以減少生物分子之間的錯配比率。蛋白質(zhì)芯片信號的檢測對吸附到蛋白質(zhì)芯片表面靶蛋白的檢測主要有兩種方式：1、以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)的直接檢測法〈如表面增強(qiáng)激光解析離子化-飛行時