第二章中藥化學成分的一般研究方法

第二章中藥化學成分的一般研究方法教學內(nèi)容Δ2.1中藥化學成分的主要類型。Δ2.2

中藥化學成分提取分離方法的基本原理及應用。2.3中藥化學成分結(jié)構(gòu)鑒定的一般程序和方法。2.1

中藥化學成分的主要類型

（一）從物質(zhì)基本類型分：有機物、無機物。（二）按元素組成、結(jié)構(gòu)母核分：生物堿、黃酮、苷、醌、甾、萜、苯丙素等。（三）按酸堿性分：酸性、堿性、中性。（四）按溶解性分：非極性（親脂性）、中極性、極性（親水性）第二章中藥化學成分的一般研究方法（五）按活性分：有效成分、無效成分具有生物活性，能用分子式和結(jié)構(gòu)式表示，并具有一定的物理常數(shù)的單體化合物，稱為有效成分。與有效成分共存的無生物活性的成分稱為無效成分。（六）按生產(chǎn)合成途徑分：一級代謝產(chǎn)物（如糖、蛋白質(zhì)）、二級代謝產(chǎn)物（如生物堿、黃酮、皂苷）。第二章中藥化學成分的一般研究方法2.2中藥化學成分提取分離方法的基本原理及應用一、基本概念1、提取：利用適當?shù)娜軇┗蚍椒?，將所要成分盡可能從原料中完全提出的過程。2、分離：將提取物中所含的各種成分一一分開，并將得到的單體加以精制的過程。二、提取方法水

溶劑提取法：溶劑

親水性有機溶劑親脂性有機溶劑水蒸氣蒸餾法超臨界流體萃取法（SFE）

升華法壓榨法

（一）溶劑提取法1、原理

根據(jù)中藥中各種成分的溶解性不同，選用對所需成分溶解度大而對其他成分溶解度小的溶劑，將所需成分從藥材組織中溶解出來的一種提取方法。選擇溶劑依據(jù)相似相溶原理。2、選擇溶劑的要點*對所要成分溶解度大*沸點適中容易回收*低毒安全中藥化學成分中，萜、甾等大環(huán)、稠環(huán)化合物極性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等極性溶劑中；酸堿性成分因存在狀態(tài)不同溶解性不同。最常用的溶劑為乙醇。3、溶劑的分類*強極性溶劑：水*親水性有機溶劑：能與水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮）*親脂性有機溶劑：不與水任意混溶，可分層（正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、環(huán)己烷、石油醚）常用溶劑的極性大小順序：石油醚<四氯化碳<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇（甲醇）<水4、化合物的結(jié)構(gòu)與親水性、親脂性的關系（1）分子結(jié)構(gòu)中親水性基團（羧基、羥基、氨基）越多，極性越大，親水性越強，反之則親脂性越強。（2）分子中非極性部分越大，碳鏈越長或結(jié)構(gòu)越大，則親脂性越強。（3）結(jié)構(gòu)母核相同的成分，分子中功能基的極性越大，或極性功能基數(shù)量越多，則整個分子的極性越大，親水性越強，親脂性越弱。5、溶劑的選擇

(1)水：為價廉、易得、使用安全的強極性溶劑。適于提取無機鹽、糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機酸鹽、生物堿鹽、苷類等。(2)親水性有機溶劑：以乙醇最常用。高濃度提取親脂性成分，低濃度提取親水性成分。(3)

親脂性有機溶劑：具有較強的選擇性，對揮發(fā)油、油脂、葉綠素、樹脂、內(nèi)酯、某些生物堿及一些苷元均可提取出來。優(yōu)缺點：沸點低，濃縮回收方便，但易燃、有毒、價貴，穿透力差。6、溶劑提取的方法浸漬法滲漉法溶劑提取的方法煎煮法回流提取法連續(xù)回流提取法超聲法（1）浸漬法：以水或稀醇反復提取，適于遇熱易破壞或揮發(fā)性成分及含淀粉、粘液質(zhì)較多的中藥。（2）滲漉法：以稀乙醇或酸水作溶劑，先浸后滲，提取效率高于浸漬法。

（3）煎煮法：以水為溶劑，對遇熱易破壞和揮發(fā)性成分有影響，對含多量淀粉、黏液質(zhì)的中藥也不適用。（4）回流提?。河糜袡C溶劑。對遇熱易破壞的成分有影響。（5）連續(xù)回流提取：用有機溶劑。提取效率高，節(jié)省溶劑。（6）超聲法7、影響溶劑提取法的因素合適的溶劑和方法、藥材的粉碎度、提取溫度及時間。（二）水蒸氣蒸餾法適于具有揮發(fā)性，能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞的有效成分的提取。揮發(fā)油、小分子生物堿、酚類、游離醌類等。（三）超臨界流體萃取法最常用的是二氧化碳超臨界萃取法，環(huán)保、成本低、提取分離一步完成。分子的極性、沸點和分子量的大小與其在二氧化碳超臨界流體中的溶解性密切相關。（四）升華法（五）壓榨法三、分離精制方法（一）溶劑法

1、酸堿溶劑法

（1）酸溶：有機堿性成分可與無機酸成鹽而溶于水。（2）堿溶：具有羧基，用碳酸氫鈉；具有酚羥基，用氫氧化鈉；具有內(nèi)酯或內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的成分可被皂化而溶于水。

使用注意：酸堿的強度、加熱溫度、與被分離成分接觸的時間等。

總提物乙酸乙酯液

酸水提取酸水層有機溶劑層調(diào)pH12NaHCO3

有機溶劑萃取

有機層水層水層有機層（堿性成分）（強極性酸化NaOH

中性物質(zhì)）有機溶劑提取萃取有機層有機層水層（有機酸）（中性）酸化有機溶劑萃取有機層（酚）2、溶劑分配法原理：利用混合物中各成分在互不相溶的兩相溶劑中分配系數(shù)不同而達到分離的方法。各成分在兩相溶劑中分配系數(shù)相差越大，則分離效率越高。一般采用全量多次分配提高萃取效率。需要注意的是防止乳化。

溶劑的選擇：對于分離極性較大的成分，用正丁醇-水；分離中等極性成分，用乙酸乙酯-水；分離低極性成分，用氯仿（或乙醚、石油醚等）-水。所用裝置：分液漏斗、連續(xù)液-液萃取裝置、液滴逆流層析裝置。（1）系統(tǒng)溶劑萃取法：常用來粗分，是將總提物分散于水中，依次用石油醚（或環(huán)己烷）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別減壓回收溶劑得到相應極性的成分。極性成分類型適宜溶劑強親脂性揮發(fā)油、脂肪油、苷元石油醚脂溶性色素、甾醇己烷親脂性苷元、生物堿、樹脂乙醚

醛、醇、酯、有機酸氯仿小強心苷氯仿-乙醇（2：1）中極性中黃酮苷乙酸乙酯大皂苷、蒽醌苷正丁醇親水性極性很大的苷、糖類丙酮

氨基酸、某些生物堿鹽甲醇、乙醇強親水性蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、氨基酸水果膠、糖類、、無機鹽類（2）逆流連續(xù)萃取法

利用兩相溶劑比重不同可自然分層和分散液滴穿過連續(xù)相溶劑時發(fā)生傳質(zhì)的原理，用一根或數(shù)根萃取管制成逆流連續(xù)萃取裝置。管內(nèi)的瓷環(huán)，增加液滴上升的路程和在連續(xù)相中停留的時間，更重要的是上升的液滴因撞擊填充物而被分散，擴大了兩相溶劑萃取的接觸面積，使更萃取完全。優(yōu)點：克服了分液漏斗多次萃取和易乳化的麻煩。（3）逆流分布法（CCD）

對性質(zhì)相似的異構(gòu)體或同系物分離效果好?；驹砣允抢没旌衔镏谐煞衷趦煞N不相混溶的溶劑中分配系數(shù)的不同，經(jīng)過在兩相溶劑中多次轉(zhuǎn)移，而使它們達到分離的目的。（4）液滴逆流層析法（DCCC）

是在逆流分布法基礎上發(fā)展的高分離效能的逆流分布法，分離管有100~1000根，互相串聯(lián)，上行法時，分離管內(nèi)充滿重相作為固定液相，利用泵將輕相（移動相）帶著樣品液進入分離管，形成液滴通過分離管，流出的移動相通過檢測，分部收集。*溶劑分配法中溶劑系統(tǒng)的選擇：

兩相溶劑不相混溶，混合物中各單一成分在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)差別越大越好。分離酸堿兩性化合物時，緩沖液是很好的溶劑。*操作注意：（1）先將兩相溶劑相互充分飽和。（2）采用等體積兩相溶劑的方式。（3）欲分離混合物的濃度不宜過高。（二）沉淀法1、酸堿沉淀法：例如：生物堿、黃酮、蒽醌2、專屬試劑沉淀法：例如：雷氏銨鹽沉淀季銨堿、膽甾醇沉淀甾體皂苷；明膠沉淀鞣質(zhì)。3、分級沉淀法：改變加入溶劑的極性或數(shù)量使沉淀逐步析出的方法。例如：多糖、蛋白質(zhì)的水溶液，分次加乙醇，使含醇量逐步提高，則可得到分子量由大到小的多糖、蛋白質(zhì)；皂苷的乙醇液，分次加入乙醚或乙醚-丙酮，可按極性從小到大逐步沉淀。4、鉛鹽沉淀法

中性醋酸鉛：與酸性或酚性物質(zhì)沉淀堿性醋酸鉛：除以上物質(zhì)外，還可沉淀具有醇羥基、酮基、醛基結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。脫鉛：通入硫化氫法；中性硫酸鹽法；陽離子交換法。5、鹽析法

在混合物的水溶液中，加入無機鹽（常用的是NaCL，其它還有Na2S、MgSO4、NH4SO4）至一定濃度或達到飽和，使某些成分沉淀析出或用有機溶劑萃取出而達到分離的目的。（三）分餾法

利用混合組分中各成分的沸點不同而分離的一種方法。用于液體混合物的分離。（四）膜分離法利用天然或人工合成的高分子膜，以外加壓力或化學位差為推動力，對混合物溶液進行分離、分級、提純和富集的方法。反滲透、超濾、微濾、電滲析及傳統(tǒng)的透析法均為膜分離技術(shù)。原理是大分子不能透過膜而被截留，小分子能透過膜，使分子大小不同的物質(zhì)得到分離。關鍵是選擇適宜的膜。（五）結(jié)晶法1、結(jié)晶的條件（1）溶劑：選擇合適的溶劑對結(jié)晶的形成是關鍵。合適的溶劑應對欲分離的成分熱時溶解度大，冷時溶解度小，而對雜質(zhì)則冷熱溶解度一致；沸點要適中；不與被分離成分產(chǎn)生化學反應。選擇溶劑依據(jù)“相似相溶”原理。（2）溫度通常在加溫的情況下，溶解過濾，除雜，濃縮，放冷。最合適的結(jié)晶溫度5~10度。（3）時間一般3~5天或更長時間。（4）濃度一般是多一些溶劑，放置使其慢慢揮發(fā)到合適的濃度。（5）雜質(zhì)（6）有效成分的含量越高，越易結(jié)晶。2、結(jié)晶溶劑的選擇對所需成分的溶解度隨溫度不同而有顯著差別，同時不發(fā)生化學反應；查閱相關文件，參考“相似相溶”規(guī)律；選擇混合溶劑，低沸點溶劑對物質(zhì)溶解度大，高沸點溶劑對物質(zhì)的溶解度??；常用溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等。（六）色譜分離法1、吸附色譜利用同一吸附劑對混合物中各種成分吸附能力的差異，而使各成分達到分離目的的色譜方法。吸附能力的強弱是由吸附劑和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)決定的。吸附色譜法的分離效果，完全由吸附劑，溶劑和被分離物質(zhì)的性質(zhì)決定。（1）常用吸附劑：*硅膠：多孔，微酸性，其吸附能力稍弱于氧化鋁。吸附作用是由于顆粒表面有很多硅醇基，它可以和許多化合物形成氫鍵而具有一定的吸附作用，所以硅膠吸附作用的強弱與硅醇基的含量有關。硅醇基還易吸附水分，吸附的水分越多，吸附其他化合物的能力越弱。吸水量超過12%就不能做為吸附劑了。

當加熱到了100-110℃時即可除去絕大多數(shù)硅醇基吸附的水分，恢復吸附活力，這一過程稱為活化。當溫度上升到500℃時，硅膠表面的硅醇基則脫水縮合轉(zhuǎn)變?yōu)楣柩醐h(huán)結(jié)構(gòu)，從而喪失吸附活性。硅膠適于分離的化合物范圍很廣泛，但不宜分離堿性化合物。*氧化鋁由氫氧化鋁直接在高溫下脫水制得，帶微堿性，適于分離堿性成分。*聚酰胺適于分離黃酮、酚、醌類、有機酸及鞣質(zhì)，可使性質(zhì)極相近的化合物得到分離。原理：聚酰胺中的酰胺基可與酚羥基、羧基、羰基、硝基等形成氫鍵吸附。聚酰胺的吸附容量大。被分離成分的結(jié)構(gòu)與吸附力的關系：1）可形成氫鍵的基團數(shù)目越多，則吸附能力越強，越難被洗脫。2）形成分子內(nèi)氫鍵的吸附能力會減弱。3）分子中芳香化程度越高，吸附能力越強。

。

4）對聚酰胺柱的洗脫能力，與溶劑的種類有關：甲酰胺，丙酮，甲、乙醇，水依次減弱。（2）溶劑對于極性吸附劑，溶劑極性越大，洗脫能力越強。對于非極性吸附劑，則相反。（3）被分離物質(zhì)對于極性吸附劑，被分離物質(zhì)的極性越強，吸附力越大，越難洗脫。（4）操作方式1）薄層色譜：制板點樣展開顯色2）柱色譜：裝柱上樣洗脫收集濃縮檢識合并結(jié)晶（二）分配色譜1、基本原理利用物質(zhì)在固定相和流動相之間分配系數(shù)不同而達到分離。2、分類正相色譜：固定相極性>流動相極性，用于分離極性和中等極性的成分。反相色譜：固定相極性<流動相極性，用于分離非極性和中等極性的成分3、洗脫規(guī)律：

正相色譜中，極性小的化合物先被洗脫，極性大的化合物后被洗脫；反相色譜正好相反。4、常用的固定相和流動相固定相：正相色譜中常用氰基或氨基鍵合相；反相色譜中常用C18或C8鍵合相。流動相：正相色譜中主要用有機溶劑；反相色譜中常用甲醇-水或乙腈-水系統(tǒng)。（三）離子交換色譜法1、基本原理基于各成分解離度的不同而分離。2、離子交換劑的種類離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠。3、應用主要用于生物堿、有機酸及氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖等水溶性成分的分離純化。4、操作要點裝柱前要用水充分溶脹，并用酸、堿預處理。（四）大孔吸附樹脂法1、性能及分離原理（1）

性能：大孔樹脂是一種不含交換基團，具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。一般為白色顆粒，20~60目。理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機溶劑。水溶液中吸附力較強，且有很好的選擇性。（2）原理既有吸附性，又有分子篩的篩選性。吸附性是范德華引力或氫鍵吸附的結(jié)果；篩選性則由其多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)引起的。2、影響分離的因素（1）

分子極性的大小極性較大的化合物適宜于在中極性的樹脂上分離，而極性較小的化合物則適于在非極性樹脂上分離。對于中極性樹脂來說，被分離化合物分子上能形成氫鍵的基團越多，吸附力越強。（2）分子體積的影響對于非極性大孔吸附樹脂而言，化合物體積越大，吸附力越強，這與大體積分子疏水性強有關。

（3）PH

一般酸性化合物在適當酸性溶液中可被充分吸附，堿性化合物則在堿性條件下易被吸附，中性化合物在中性情況下吸附較好。3、樹脂柱的清冼和再生

用乙醇、丙酮、異丙醇、2~5%鹽酸、2~5%氫氧化鈉滲漉法洗脫或回流。4、洗脫順序

一般被分離物質(zhì)極性越小，越先被洗脫下來，極性越大，越后洗脫下來。5、應用（1）成分的類型與樹脂的選擇：（2）優(yōu)點：吸附容量大，選擇性好，成本低，收率較高，再生容易等優(yōu)點。

成分類型大孔樹脂類型

樹脂型號舉例脂溶性成分（甾、萜、黃酮、苯丙素、生物堿）非極性或弱極性樹脂D-101,AB-8,HPD-100皂苷、生物堿苷弱極性或極性D-201,D-301,HPD-300,AB-8,NKA-9黃酮苷、蒽醌苷、苯丙素苷弱極性或極性樹脂D-201,D-301,HPD-600,AB-8,NKA-9環(huán)烯醚萜苷極性樹脂D-301,HPD-600,NKA-9（五）凝膠色譜法1、性能及分類葡聚糖凝膠是葡聚糖和甘油，通過醚橋鍵相交而成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)。交鏈度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密，網(wǎng)孔越小，吸水膨脹就越大，可用于小分子量物質(zhì)的分離。反之，則用于大分子量物質(zhì)的分離。常用的有葡聚糖凝膠（SephadexG）、羥丙基葡聚糖凝膠（SephadexLH-20）、聚丙烯酰胺凝膠（Sephacrylose,商品名Bio-gelP）及瓊脂糖凝膠（Sepharose,商品名Bio-GelA）等。2、分離原理

葡聚糖凝膠吸水后，形成凝膠粒子，在交鏈鍵的骨架中存在著許多網(wǎng)眼，只能使小分子量的化合物進入，大分子量的化合物被排阻在凝膠顆粒的外部難以進入網(wǎng)眼內(nèi)部，因此大分子物質(zhì)首先被洗出。3、應用

主要用于分離水溶性大分子化合物。（六）高效液相色譜（七）氣相色譜(八）超臨界流體萃取

是集提取和分離于一體，又基本上不用有機溶劑的新技術(shù)。當一種物質(zhì)處于臨界溫度與臨界壓力以上的狀態(tài)下，形成即非液體又非氣體的單一相態(tài)，稱超臨界流體（SCF）。

利用一種物質(zhì)在超臨界區(qū)域形成的流體進行提取的方法稱SCFE。SCF與常溫常壓下的氣體和液體比較，其密度接近液體，而粘度又接近氣體，擴散系數(shù)比液體大100倍，浸透性優(yōu)于液體。

物質(zhì)的溶解過程包括分子間的相互作用和擴散作用。所以物質(zhì)的溶解度與溶劑的密度、擴散系數(shù)成正比與粘度成反比，因此超臨界流體對許多物質(zhì)有很強的溶解能力。

SCF做流動相時，兼具氣層和液層的特點，可以分離氣相不能適用的不揮發(fā)性的較大分子，又能分離揮發(fā)油，其分離速度比液相可以快5~10倍，分辨能力大5倍。常用的超臨界流體為CO2,它的臨界溫度為31.4℃，臨界壓力為7.37Mpa,易操作，價格便宜，無毒?？梢酝ㄟ^改變壓力而改變超臨界流體的特性，因為在一定溫度條件下，改變壓力即可改變流體的密度和極性，利用程序升壓即可將不同極性成分進行分步提取。

CO2

在高于臨界溫度和壓力的條件下，溶解出中藥原料中的成分，當恢復常壓時，溶解在CO2超臨界流體中的成分便與氣體CO2自動分離。

二氧化碳超臨界流體對物質(zhì)溶解作用有一定選擇性，極性較低的化合物，如酯、醚、內(nèi)酯和含氧化合物易被萃取；極性化合物，如帶羥基、羧基的難于萃取。也可以在流動相中加入夾帶劑以改變其性能。對溶質(zhì)具有較好溶解性的溶劑也往往是很好的夾帶劑，常用甲、乙醇、丙酮，夾帶劑的