第六章,電泳技術(shù)及儀器

第六章電泳技術(shù)與儀器鄭芳重點(diǎn)提示電泳技術(shù)的基本原理是什么？影響電泳的因素有哪些？電泳技術(shù)按分離的原理可分為哪幾類？不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的原理是什么？SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的基本原理是什么？聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳的基本原理是什么？毛細(xì)管電泳的基本原理是什么？毛細(xì)管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)有哪些？常用電泳儀的基本結(jié)構(gòu)有哪些？電泳技術(shù)在臨床上可應(yīng)用于哪些方面？目錄第一節(jié)電泳技術(shù)的基本原理和分類第二節(jié)常用電泳分析方法第三節(jié)電泳儀的基本結(jié)構(gòu)第四節(jié)電泳技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用發(fā)展歷程1809年，俄國科學(xué)家列伊斯，發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。1937年瑞典科學(xué)家Tiselius建立了界面電泳技術(shù)，證明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ蛋白組成，獲得1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1950年后，區(qū)帶電泳從發(fā)展到成熟。1980年以來，毛細(xì)管電泳逐漸受到重視。第一節(jié)電泳技術(shù)的基本原理和分類電泳（electrophoresis,EP）帶電荷的溶質(zhì)或顆粒在電場中移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳技術(shù)（electrophoresistechnique）利用電泳現(xiàn)象將多組分物質(zhì)各組分分離的技術(shù)。電泳儀采用電泳技術(shù)分離多組分物質(zhì)的儀器。一、基本原理電泳技術(shù)已廣泛用于蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核苷酸、無機(jī)離子等成份的分離和鑒定，甚至還用于細(xì)胞與病毒的研究。一般來說，不同成分的物質(zhì)，其顆粒本身所帶的電量以及顆粒的半徑(或摩擦系數(shù))都是不同的，所以它們的遷移率各不相同。利用這一原理即可把物質(zhì)中各種不同的成分分離開來。例如，血清蛋白電泳分離含有各種蛋白質(zhì)(清蛋白、α1,α2,β,γ球蛋白等)，：介質(zhì)粘度r：粒子半徑Q：荷電量一、基本原理若溶液里一電量為q的帶電粒子，在場強(qiáng)為E的電場中以速度v移動(dòng)，則它所受到的電場力F1應(yīng)為：

F1=QE根據(jù)斯托克司定律，在液體中泳動(dòng)的球狀粒子所受到的阻力F2

，為：

F2=6πηRV

式中η為介質(zhì)的粘度系數(shù)，R為粒子半徑。當(dāng)二力平衡，即F1=F2時(shí)，粒子作勻速運(yùn)動(dòng)。且有

V=QE/6πrη從上式可以看出粒子泳動(dòng)速度不僅與本身性質(zhì)有關(guān)，還受到外界因素的影響二、影響因素1.內(nèi)在因素：電荷的正負(fù)、大小、形狀、分子量2.外界因素：

電場強(qiáng)度

溶液性質(zhì)：pH值、離子強(qiáng)度、溶液粘度

電滲作用

吸附作用

焦耳熱電滲作用：在電場中，由于多孔支持物吸附水中的正負(fù)離子，使溶液相對帶電，在電場作用下，溶液就向一定的方向移動(dòng)，此種情況稱為電滲現(xiàn)象。單位場強(qiáng)下的液體移動(dòng)速度稱為電滲速度。液體的電滲速度與固液兩相間的ξ電勢成簡單的正比關(guān)系，所以可以利用電滲來測量ξ電勢，但此法只限于能形成毛細(xì)管或多孔介質(zhì)的材料。三、分類1.按分離原理分類：區(qū)帶電泳ZEP、移界電泳MBEP、等速電泳ITP、等電聚焦電泳IEF、免疫電泳IEP。（1）區(qū)帶電泳是在一定的支持物上，于均一的載體電解質(zhì)中，將樣品加在中部位置，在電場作用下，樣品中帶正或負(fù)電荷的離子分別向負(fù)或正極以不同速度移動(dòng)，分離成一個(gè)個(gè)彼此隔開的區(qū)帶。區(qū)帶電泳按支持物的物理性狀不同，又可分為紙和其他纖維膜電泳、凝膠電泳等。（2）移界電泳移動(dòng)界面電泳是將被分離的離子（如陰離子）混合物置于電泳槽的一端（如負(fù)極），在電泳開始前，樣品與載體電解質(zhì)有清晰的界面。電泳開始后，帶電粒子向另一極（正極）移動(dòng)，泳動(dòng)速度最快的離子走在最前面，其他離子依電極速度快慢順序排列，形成不同的區(qū)帶。只有第一個(gè)區(qū)帶的界面是清晰的，達(dá)到完全分離，其中含有電泳速度最快的離子，其他大部分區(qū)帶重疊，已淘汰。（3）等速電泳在樣品中加有領(lǐng)先離子（其遷移率比所有被分離離子的大）和終末離子（其遷移率比所有被分離離子的?。?，樣品加在領(lǐng)先離子和終末離子之間，在外電場作用下，各離子進(jìn)行移動(dòng)，經(jīng)過一段時(shí)間電泳后，達(dá)到完全分離。被分離的各離子的區(qū)帶按遷移率大小依序排列在領(lǐng)先離子與終末離子的區(qū)帶之間。所得到的區(qū)帶是相互連接的，且因“自身校正”效應(yīng)，界面是清晰的，這是與區(qū)帶電泳不同之處。（4）等電聚焦電泳利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個(gè)pH梯度，電泳時(shí)每種蛋白質(zhì)就將遷移到等于其等電點(diǎn)（pI）的pH處（此時(shí)此蛋白質(zhì)不再帶有凈的正或負(fù)電荷），形成一個(gè)很窄的區(qū)帶，分辨率極高。支持介質(zhì)電泳濾紙電泳醋酸纖維素薄膜電泳凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳毛細(xì)管電泳2.按載體分類：自由電泳和支持介質(zhì)電泳自由電泳顯微鏡電泳柱電泳移動(dòng)界面電泳等速電泳三、分類第二節(jié)常用電泳分析方法電泳檢測的一般步驟①點(diǎn)樣②電泳③染色使用不同的染料或者底物，檢測不同類型的蛋白:血清蛋白、脂蛋白、各種酶類、血紅蛋白。④結(jié)果分析一、醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳（celluloseacetatemembraneelectrophoresis）以醋酸纖維素薄膜為支持介質(zhì)的電泳。特點(diǎn)：染色條帶清楚

、快速省時(shí)

、靈敏度高，樣品用量少

、結(jié)果可長期保存、應(yīng)用廣泛

。醋酸纖維素薄膜電泳分離血清清蛋白二、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳（agarosegelelectrophoresis）：以瓊脂糖為支持介質(zhì)進(jìn)行的電泳。特點(diǎn)：具有大量微孔，其濃度決定孔徑大小；電泳圖譜清晰、分辨率高、重復(fù)性好；可進(jìn)行定性或定量檢測。三、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）：以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳。（一）聚丙烯酰胺凝膠特性

Acr單體可通過兩種催化體系，在加速劑TEMED的作用下發(fā)生聚合反應(yīng)。凝膠的孔徑、濃度與被分離物質(zhì)分子量之間有密切的關(guān)系。PAGE的性能取決于凝膠的總濃度和單體Acr與交聯(lián)劑Bis之比。（二）不連續(xù)PAGE的分離原理：濃縮效應(yīng)（A）樣品膠、濃縮膠和分離膠中均有快離子，慢離子放在兩個(gè)電極槽中，緩沖配對離子存在于整個(gè)體系中；（B）電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄區(qū)帶；（C）蛋白質(zhì)樣品被分離成數(shù)個(gè)區(qū)帶。三、聚丙烯酰胺凝膠電泳

緩沖體系的離子成分及pH的不連續(xù)性濃縮效應(yīng)示意圖三、聚丙烯酰胺凝膠電泳（二）不連續(xù)PAGE的分離原理：分子篩效應(yīng)相對分子質(zhì)量或分子大小和形狀的物質(zhì)通過一定孔徑的分離膠時(shí)，受阻滯程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)（molecularsieveeffect）。（二）不連續(xù)PAGE的分離原理：電荷效應(yīng)（二）常用的聚丙烯酰胺電泳技術(shù)（展）1.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2.聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳3.聚丙烯酰胺等電聚焦電泳4.聚丙烯酰胺雙向電泳三、聚丙烯酰胺凝膠電泳（1）SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長的函數(shù)。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱SDS—PAGE）。一、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳二、梯度凝膠電泳增加分子篩效應(yīng)隨著泳動(dòng)距離增加而丙烯酰胺濃度也逐漸增加的梯度聚丙烯酰胺凝膠,目前已廣泛用來代替單一濃度的凝膠。濃度梯度膠隨濃度增加而孔徑逐漸變小,這將對蛋白質(zhì)組成的分析更為細(xì)致,同時(shí)能獲得更清晰的蛋白質(zhì)區(qū)帶。變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據(jù)DNA片段的熔解性質(zhì)而使之分離的凝膠系統(tǒng)。

凈電荷與PH的關(guān)系曲線三、等電聚焦電泳—電荷效應(yīng)

1．等電聚焦電泳過程一種利用有pH值梯度的介質(zhì)，分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。

在一個(gè)穩(wěn)定連續(xù)的線性pH梯度的溶液（兩性載體電解質(zhì)）中進(jìn)行分離，每一種被分離的兩性物質(zhì)都移向與它的等電點(diǎn)相一致的pH位置，在那里不再移動(dòng)（稱為聚焦）。

凈電荷與PH的關(guān)系曲線

等電聚焦電泳的特點(diǎn)①使用兩性載體電解質(zhì)，在電極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)、線性的pH梯度；②由于“聚焦效應(yīng)”，即使很小的樣品也能獲得清晰、鮮明的區(qū)帶界面；③電泳速度快;④分辨率高;⑤加入樣品的位置可任意選擇；⑥可用于測定蛋白質(zhì)類物質(zhì)的等電點(diǎn);⑦適用于中、大分子量（如蛋白質(zhì)、肽類、同工酶等）生物組分的分離分析。四、雙向凝膠電泳（二維電泳）

第一向采用等電聚焦根據(jù)復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分中各個(gè)蛋白質(zhì)的PI的不同，將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。

第二向采用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）就是按蛋白質(zhì)分子量的大小使其在垂直方向進(jìn)行分離。其結(jié)果不再是條帶狀，而是呈現(xiàn)為斑點(diǎn)狀。

雙向凝膠電泳儀膠性PH9中電加解入質(zhì)了溶雙液

PH3加上電場后建立穩(wěn)定PH梯度蛋白質(zhì)溶液加入，建立電場染色后，蛋白質(zhì)因PI值不同，沿PH梯度分離開第一向等電聚焦PI逐漸降低等電聚焦膠放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠上

第二向SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量逐漸降低PI逐漸降低雙向凝膠電泳示意圖第二節(jié)常用電泳方法毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis,CE)

以內(nèi)徑20～200nm的柔性毛細(xì)管柱作為分離通道、以高壓直流電場作為驅(qū)動(dòng)力，對各種小分子、大分子或細(xì)胞等進(jìn)行高效分離、檢測或微量制備等有關(guān)技術(shù)的總稱。（一）基本原理電滲流（

electro-osmoticflow,EOF）；EOF是推動(dòng)流動(dòng)相的驅(qū)動(dòng)力，對物質(zhì)的分離起著重要作用四、毛細(xì)管電泳四、毛細(xì)管電泳（二）優(yōu)點(diǎn)熱效應(yīng)低高靈敏度、高分辨率

所需樣品少、檢測速度快自動(dòng)化程度高、操作簡便、成本低（三）分類毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管等電聚焦毛細(xì)管膠束電泳毛細(xì)管電色譜毛細(xì)管等速電泳四、毛細(xì)管電泳（一）毛細(xì)管區(qū)帶電泳它是通過在充滿電解質(zhì)溶液的毛細(xì)管中，不同質(zhì)荷比大小的組分，在電場的作用下，依遷移速度的不同而進(jìn)行分離。根據(jù)組分的遷移時(shí)間進(jìn)行定性，根據(jù)電泳峰的峰面積或峰高進(jìn)行定量分析。

毛細(xì)血管區(qū)帶電泳原理圖毛細(xì)管電泳的分離模式（二）毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)常用聚丙烯酰胺在毛細(xì)管內(nèi)交聯(lián)制成凝膠柱，依據(jù)分離支撐物的分離作用不同，CGE又分為非變性CGE和變性CGE，前者以分子篩、電荷／質(zhì)量比的作用進(jìn)行分離；后者則以質(zhì)量、分子篩的作用進(jìn)行分離。適用于分離、測定肽類、蛋白質(zhì)、DNA類物質(zhì)的分離。

（三）毛細(xì)管等電聚焦電泳不同等電點(diǎn)的分子分別聚集在不同的位置上，不作遷移而彼此分離，這就是等電聚焦分離過程。毛細(xì)管的等電聚焦是在毛細(xì)管內(nèi)實(shí)現(xiàn)的等電聚焦過程，具有極高的分辨率，通?？梢苑蛛x等電點(diǎn)差異小于0.01pH單位的兩種蛋白質(zhì)，例如肽類、蛋白質(zhì)的分離。

毛細(xì)管等電聚焦電泳儀（四）毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MECC)MECC系統(tǒng)中存在兩個(gè)相：流動(dòng)的水相和起到固定相作用的膠束相。在含有膠束的流動(dòng)相中，溶質(zhì)在“水相”和“膠束相”(準(zhǔn)固定相)之間進(jìn)行分配，即使是中性溶質(zhì)，因其本身疏水性不同，在二者之間的分配也會(huì)有差異，疏水性強(qiáng)的溶質(zhì)在“膠束相”中停留時(shí)間長，遷移速度就慢。反之，親水性強(qiáng)的溶質(zhì)遷移速度就快，最終中性溶質(zhì)將依其疏水性不同而得以分離。毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜原理圖

（五）毛細(xì)管電色譜

它包含了電泳和色譜兩種機(jī)制，是在毛細(xì)管中填充或在毛細(xì)管壁上鍵合（或涂壁）固定相，從而構(gòu)成毛細(xì)管色譜柱，依靠電滲流推動(dòng)流動(dòng)相，攜帶樣品遷移，根據(jù)樣品分子的質(zhì)荷比、分子尺寸及分配系數(shù)的差別而分離。

CEC-加壓毛細(xì)管電色譜儀（六）毛細(xì)管等速電泳毛細(xì)管內(nèi)首先導(dǎo)入具有比被分離各組分高電泳淌度的前導(dǎo)電解質(zhì)，然后進(jìn)樣，隨后再導(dǎo)入比各分離組份低電泳淌度的尾隨電解質(zhì)，在強(qiáng)電場的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)電解質(zhì)與尾隨電解質(zhì)之間的空隙中發(fā)生分離。

（七）毛細(xì)管電泳芯片

毛細(xì)管電泳芯片是在常規(guī)毛細(xì)管電泳的原理和技術(shù)基礎(chǔ)上，利用微加工技術(shù)在平方厘米級大小的芯片上加工出各種微細(xì)結(jié)構(gòu)，如通道和其它功能單元，通過不同的通道、反應(yīng)器、檢測單元等的設(shè)計(jì)和布局，實(shí)現(xiàn)樣品的進(jìn)樣、反應(yīng)、分離和檢測，是一種多功能化的快速、高效和低耗的微型實(shí)驗(yàn)裝置。微流控分析芯片微流控分析芯片目的是通過化學(xué)分析設(shè)備的微型化與集成化，最大限度地把分析實(shí)驗(yàn)室的功能轉(zhuǎn)移到便攜的芯片中。微流控分析芯片通過微機(jī)電加工技術(shù)把整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的功能，包括采樣、稀釋、加試劑、反應(yīng)、分離、檢測等集成在幾平方厘米的微流控芯片上，且可多次使用，因而極大地減少了樣品和分析試劑的用量，降低了分析的成本，加快了分析的速度，具有廣泛的適用性。第三節(jié)電泳儀的基本結(jié)構(gòu)一、常用電泳儀的基本結(jié)構(gòu)Grassmann-Hanning型濾紙電泳槽

常用電泳儀的基本結(jié)構(gòu)及技術(shù)指標(biāo)一、常用電泳設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)（一）電源（二）電泳槽（三）附加裝置

平臥式電泳槽裝置示意圖二、毛細(xì)管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)毛細(xì)管電泳儀示意圖毛細(xì)管內(nèi)徑、長度、壁厚度高壓、毛細(xì)管柱、檢測、進(jìn)樣、冷卻系統(tǒng)。樣本架及試管ID號的閱讀器樣本稀釋杯稀釋針樣本盤二、毛細(xì)管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)光導(dǎo)纖維Peltier溫控元件溫控裝置的分解圖毛細(xì)管洗滌系統(tǒng)二、毛細(xì)管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)第四節(jié)電泳技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用電泳技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用一、血清蛋白電泳二、尿蛋白電泳三、血紅蛋白電泳四、糖化血紅蛋白電泳五、免疫固定電泳六、同工酶電泳七、腦脊液蛋白電泳八、脂蛋白電泳急性燒傷病人的電泳圖譜

大面積燒傷病人,其圖譜顯示Alb、α1、γ顯著減少而α2明顯增加.臨床上產(chǎn)生低蛋白血癥,其原因:一是血清滲出,二是皮膚丟失

急性肝臟疾病三、血紅蛋白電泳正常血紅蛋白電泳曲線HbAHbA2HbAHbA2異常血紅蛋白電泳曲線HbAHbFHbBart一、血清蛋白電泳異常血清蛋白質(zhì)電泳圖譜的分型及其特征血清蛋白質(zhì)的圖譜類型

總蛋白Albα1α2βγ1.低蛋白血癥↓↓↓↓N↑N↓N↑2.腎病型↓↓↓↓↑↑↑不定3.肝硬化型↓N↑↓↓N↓N↓β-γ↑橋4.急性炎癥或急性時(shí)相反應(yīng)癥N↓N↑↑N5.慢性炎癥型

↓↑↑↑6.彌漫性肝損害型↓N↓↓↑↓↑7.彌漫寬γ球蛋白血癥型↑↓N↑↑8.M蛋白血癥型

在α-γ區(qū)帶中出現(xiàn)M蛋白峰-M區(qū)帶峰9.高α2（β）球蛋白血癥↓↑↑↑10.妊娠型（高α型）↓N↓↑↑N11.蛋白質(zhì)缺陷型個(gè)別區(qū)帶出現(xiàn)特征性缺乏一、血清蛋白電泳二、尿蛋白電泳腎小管的廢棄物排放最后形成的尿液含有1/3的白蛋白和2/3球蛋白腎小管重新吸收白蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白免疫球蛋白小分子蛋白腎小球過濾白蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白免疫球蛋白小分子蛋白小分子蛋白>67kDa<67kDa尿蛋白含量增加主要的尿蛋白的電泳條帶區(qū)域分析起源于腎小管的各類蛋白(分子量<67kDa)起源于腎小球的各類蛋白(分子量>67kDa)白蛋白(分子量:67kDa)a1-微球蛋白(MW:33kDa)游離輕鏈(MW25kDa)轉(zhuǎn)鐵蛋白(MW:80kDa)Cystatin(MW:11kDda)b2-微球蛋白(MW:12kDa)溶菌酶(MW:15kDa)視黃醇結(jié)合蛋白(MW:21kDa)游離輕鏈的二聚體(MW50kDa)IgG(MW:160kDa)IgA(MW:165kDa)結(jié)合珠蛋白加樣位置a2-巨球蛋白(MW:900kDa)二、尿蛋白電泳五、免疫固定電泳正常血清標(biāo)本IgGl單克隆免疫球蛋白(近負(fù)極端)六、同工酶電泳乳酸脫氫酶同工酶(Lactatedehydrogenase,LDH)肌酸激酶同工酶(Creatinekinase,CK)堿性磷酸酶同工酶(Alkalinephosphatase,ALP)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartatetransaminase,AST)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase,GGT)-淀粉酶同工酶(

-Amylase,AMY)乳酸脫氫酶