干細胞與組織工程間充質干細胞及其應用

干細胞與組織工程間充質干細胞及其應用第一頁，共三十六頁，2022年，8月28日間充質干細胞與骨關節(jié)疾病一.概述二.間充質干細胞的來源三.間充質干細胞的生物學特性四.間充質干細胞的分離培養(yǎng)五.間充質干細胞的誘導分化六.間充質干細胞的臨床應用研究第二頁，共三十六頁，2022年，8月28日一.概述何謂間充質干細胞？

間充質干細胞（MesenchymalStemCell，

MSC）具有亞全能分化潛能，在特定的體內外環(huán)境下，具有向多種類型細胞分化的能力，可以分化為骨、軟骨、肌腱、脂肪、心臟、肝臟、神經(jīng)、上皮等多種細胞。由于能分化為多種中胚層來源的間質細胞而得名。MSC應用廣泛第三頁，共三十六頁，2022年，8月28日二.間充質干細胞的來源骨髓來源的MSC肌肉來源的MSC

骨來源的MSC

軟骨來源的MSC

腱來源的MSC

脂肪來源的MSC

臍帶血來源的MSC

第四頁，共三十六頁，2022年，8月28日二.間充質干細胞的來源

間充質干細胞廣泛分布于胎兒和成體的骨膜、松骨質、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、臍帶、臍帶血中。骨髓來源的MSC

僅占骨髓細胞的0.001‰～0.1‰

第五頁，共三十六頁，2022年，8月28日二.間充質干細胞的來源骨髓來源的MSC第六頁，共三十六頁，2022年，8月28日二.間充質干細胞的來源臍帶血來源的MSC

第七頁，共三十六頁，2022年，8月28日三.間充質干細胞的生物學特性（一）MSC形態(tài)特征及生長特性第八頁，共三十六頁，2022年，8月28日三.間充質干細胞的生物學特性（二）MSC分化潛能

具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內或體外環(huán)境下不僅可分化為造血細胞，還具有分化為肌細胞、肝細胞、成骨細胞、軟骨細胞、基質細胞等多種細胞的能力。第九頁，共三十六頁，2022年，8月28日過氧化物酶體增殖激活受體-2第十頁，共三十六頁，2022年，8月28日第十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日三.間充質干細胞的生物學特性(三)

MSC的表面標志及鑒定MSC沒有一個獨特的已知表面標志物。

目前比較公認的鑒定方法是：

MSC缺乏：造血干細胞標志CD34,CD45,CD11b

MSC表達：CD90，CD71，CD44第十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日三.間充質干細胞的生物學特性（四）MSC免疫學特性

1.MSC低免疫原性不表達MHC-II類分子和Fas-L;也不表達B7-1,B7-2…..

2.MSC具有免疫調節(jié)功能

通過細胞間的相互作用及產(chǎn)生細胞因子抑制T細胞的增殖及其免疫反應，從而發(fā)揮免疫重建的功能。

正是由于間充質干細胞所具備的上述免疫學特性:

*

MSC在自身免疫性疾病以及各種替代治療等方面具有廣闊的臨床應用前景。

*通過自體移植MSC可以重建組織器官的結構和功能，并且可避免免疫排斥反應。

第十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日三.間充質干細胞的生物學特性（五）MSC具有來源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴增和純化，多次傳代擴增后仍具有干細胞特性。

第十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日四.間充質干細胞的分離培養(yǎng)（一）間充質干細胞的分離1.貼壁分離法（全骨髓法或一步法）：例：小鼠骨髓間充質干細胞的分離1)取4~6周齡正常昆明鼠2只的股骨和脛骨，用PBS洗凈，去掉干骺端2)用1ml無菌注射器，吸取1ml含9%FBS的RPMI-1640，12μM的L-谷氨酰胺、1%青霉素和1%鏈霉素的篩選培養(yǎng)基（CIM），沖出骨髓

第十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日（一）間充質干細胞的分離

1.貼壁分離法：

3)將骨髓吹打均勻后，靜置5分鐘，以2×106/ml接種到25cm2培養(yǎng)瓶內，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).4）24~48h后，換液，棄去未貼壁細胞，PBS洗3次，每3~4天換一次液.

5）待細胞90%融合后傳代（大約10~14天），用0.05%的胰酶和0.02%EDTA消化3分鐘，含血清的培養(yǎng)基終止消化，1000rpm，5min離心，收集細胞,1：2傳代。四.間充質干細胞的分離培養(yǎng)第十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日（一）間充質干細胞的分離單純上述貼壁分離法難以獲得純的MSC。2.密度梯度離心法：

人骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)常用此法。根據(jù)各種骨髓細胞比重不同獲取單個核細胞進行貼壁培養(yǎng)。3.差速貼壁4.FCM5.免疫磁珠法四.間充質干細胞的分離培養(yǎng)第十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日四.間充質干細胞的分離培養(yǎng)（二)間充質干細胞的二維培養(yǎng)1.低氧張力下的培養(yǎng)2.極低密度傳代培養(yǎng)3.基因轉染的MSC培養(yǎng)第十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日四.間充質干細胞的分離培養(yǎng)(三）間充質干細胞的三維培養(yǎng)由于二維培養(yǎng)存在著如下缺點：1.貼壁的表面積有限，細胞產(chǎn)量低；2.無菌操作過程繁瑣，容易污染；3.代謝產(chǎn)物排除不及時，細胞生長不良；4.細胞離開體內三維結構，生物學行為受影響有學者采用膠原海綿進行三維灌注培養(yǎng)，較好。但尚有諸多問題待解決。第十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日五.間充質干細胞的誘導分化（一）間充質干細胞的定向誘導分化1.向骨組織的誘導分化

地塞米松

－甘油磷酸抗壞血酸

1,25-（OH）2-D3TGF-IL-6BMP-2

透明質酸誘導因素鑒定標志堿性磷酸酶；骨橋蛋白；骨鈣蛋白；第二十頁，共三十六頁，2022年，8月28日堿性磷酸酶染色顯示成骨作用第二十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日VonKossa染色顯示含鈣組織細胞第二十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日五.間充質干細胞的誘導分化（一）間充質干細胞的定向誘導分化2.向軟骨組織的誘導分化分離得到的MSC先經(jīng)低速離心形成細胞微團，之后加入無血清培養(yǎng)體系。誘導因素TGF-3Cartilage-derivedmorphogeneticprotein-1,CDMP-1integrin鑒定標志CollagenIICollagenIXCartilageoligomericmatrixprotein,COMP第二十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日五.間充質干細胞的誘導分化（一）間充質干細胞的定向誘導分化3.向脂肪組織的誘導分化誘導因素地塞米松胰島素吲哚美辛(消炎痛)鑒定標志脂肪染色過氧化物酶體增殖激活受體-2脂蛋白脂肪酶脂肪酶結合蛋白aP2第二十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日油紅O染色鑒定成脂作用第二十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日油紅O染色鑒定成脂作用第二十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日五.間充質干細胞的誘導分化（一）間充質干細胞的定向誘導分化4.向肌肉組織的誘導分化

誘導因素鑒定標志兩性霉素B5-氮雜胞苷5-氮-2’脫氧胞苷多核細胞（形態(tài)）肌球蛋白肌細胞生成素等第二十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日五.間充質干細胞的誘導分化（一）間充質干細胞的定向誘導分化5.向其他中胚層組織的分化

6.檢測細胞分化的其他方法上述組織化學…..分子生物學….

第二十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日五.間充質干細胞的誘導分化（二）間充質干細胞與相關因子1.TGF-家族對MSC的作用

TGF-促進MSC分化（成骨）

TGF-與其他因子的協(xié)同作用，如與IGF-I的協(xié)同作用（成軟骨）2.BMP對MSC的作用

BMP-2可誘導MSC向成骨和成脂肪方向分化第二十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日五.間充質干細胞的誘導分化（二）間充質干細胞與相關因子3.FGF對MSC的作用

MSC表面有FGF1和FGF2的受體（促增殖)*bFGF單獨作用具有有絲分裂原作用*bFGF與BMP-2協(xié)同作用可促進MSC的成骨能力第三十頁，共三十六頁，2022年，8月28日六.間充質干細胞的臨床應用研究（一）MSC在軟骨組織修復中的應用（1）軟骨表型的誘導分化前述（2）工程化軟骨組織的體外構建

（3）細胞-支架復合物植入組織缺損處第三十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日

分離得到的MSC先經(jīng)低速離心形成細胞微團，之后加入無血清培養(yǎng)體系。誘導因素TGF-3Cartilage-derivedmorphogeneticprotein-1,CDMP-1integrin鑒定標志CollagenIICollegenIXCartilageoligomericmatrixprotein,COMP軟骨表型的誘導分化第三十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日軟骨組織工程基本方法示意圖A獲取骨髓組織B分離、培養(yǎng)MSCC制備三維支架D將種子細胞種植于支架E將細胞-支架復合物植入組織缺損處第三十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日實驗中的組織工程耳第三十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日六.間充質干細胞的臨床應用研究（二）MSC在骨組織修復中的應用1.骨組織工程種子細胞的來源骨髓來源的MSC最有優(yōu)勢。2.MSC