微生物的數(shù)量和大小測(cè)定2011.9.28

實(shí)驗(yàn)4微生物大小和數(shù)量測(cè)定學(xué)習(xí)使用鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺在顯微鏡下測(cè)定微生物大小的方法。(一)微生物大小的測(cè)定一、目的要求對(duì)于病毒、細(xì)菌、放線菌、真菌和原生動(dòng)物等不同類型的微生物來(lái)說(shuō)，它們的大小存在很大的差異。在同一類型中不同種類的微生物，或同一種類中不同時(shí)期的微生物個(gè)體，它們的大小也存在很大的差異。二、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）2、器材：顯微鏡、鏡臺(tái)測(cè)微尺、目鏡測(cè)微尺三、實(shí)驗(yàn)步驟1、目鏡測(cè)微尺的校正鏡臺(tái)測(cè)微尺有刻度的一面朝上，置顯微鏡載物臺(tái)上，先在低倍鏡下，將鏡臺(tái)測(cè)微尺有刻度的部分移至視野中央。轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡使目鏡測(cè)微尺的刻度與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行。利用移動(dòng)器移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺(tái)微尺和目鏡微尺所占的格數(shù)。計(jì)算40x下目鏡測(cè)微尺的校正值。目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度（um）＝兩重合線間鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)×10/兩重合線間目鏡測(cè)微尺格數(shù)2、細(xì)胞大小的測(cè)量酵母菌懸液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，置顯微鏡載物臺(tái)上。用目鏡測(cè)微尺測(cè)量細(xì)胞寬和長(zhǎng)。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出目鏡測(cè)微尺校正結(jié)果以及酵母菌大小測(cè)定結(jié)果四、思考題1、為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺重新對(duì)目鏡測(cè)微尺進(jìn)行校正？2、在不改變目鏡和目鏡測(cè)微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來(lái)測(cè)定同一細(xì)菌的大小時(shí)，其測(cè)定結(jié)果是否相同？為什么？1、明確血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理。2、掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。

(二)微生物數(shù)量的測(cè)定一、目的要求二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞總數(shù)的測(cè)定（包括活的和已喪失活力的細(xì)菌）1、比濁法2、染色涂片計(jì)數(shù)法3、顯微直接計(jì)數(shù)法1、比濁法比濁法的原理是利用細(xì)菌細(xì)胞在溶液中數(shù)量越多，濁度越大，在光電比色計(jì)中測(cè)定時(shí)所吸收的光線越多。2、染色涂片計(jì)數(shù)法取0.01ml的菌懸液放在1cm2的玻片上，讓其干燥，然后固定染色，再置顯微鏡下計(jì)數(shù)每一視野中的菌數(shù)，算出視野面積，按下列公式即可求出每ml原菌液中的含菌數(shù)。每ml原菌液中的含菌數(shù)=視野中的平均菌數(shù)×1cm2/視野面積×100×稀釋倍數(shù)3、顯微直接計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計(jì)菌器)，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種方法。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速。缺點(diǎn)是所測(cè)得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn)，如結(jié)合活菌染色，微室培養(yǎng)等方法來(lái)達(dá)到只計(jì)數(shù)活菌體的目的。

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室是由一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格；共計(jì)400個(gè)小方格。每一個(gè)大方格的面積為1mm2，蓋玻片與計(jì)數(shù)區(qū)之間的高度為0.1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3。計(jì)數(shù)時(shí)，通常在40×下數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，以及大方格中的總菌數(shù)，再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。(1ml=?mm3)１個(gè)計(jì)數(shù)室＝１×１mm包含５×５個(gè)中方格１個(gè)中方格＝４×４個(gè)小方格三、實(shí)驗(yàn)器材

1、菌種：釀酒酵母2、器材：顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板等四、實(shí)驗(yàn)步驟1—顯微直接計(jì)數(shù)法

1、在10×和40×下找到計(jì)數(shù)室。2、蓋上蓋玻片將搖勻的釀酒酵母菌（或大腸桿菌）懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室。如滴入過(guò)多，溢出并流入兩側(cè)槽內(nèi)，使蓋玻片浮起，體積改變，會(huì)影響計(jì)數(shù)結(jié)果，需用濾紙把多余的溶液吸出，以槽內(nèi)沒(méi)有溶液為宜。如滴入溶液過(guò)少，經(jīng)多次充液，易產(chǎn)生氣泡，應(yīng)洗凈計(jì)數(shù)室，干燥后重做。

3、靜止5min（為什么），先用低倍鏡將計(jì)數(shù)室移至視野中央。4、在高倍下計(jì)數(shù)：每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格(4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于分布在刻線上的細(xì)菌，依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右“的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、統(tǒng)計(jì)五個(gè)大格中的細(xì)胞數(shù)量記數(shù)大格12345細(xì)胞記數(shù)2、計(jì)算每毫升酵母菌懸液的細(xì)胞數(shù)。六、思考題1、根據(jù)你的體會(huì)，說(shuō)明用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來(lái)自哪些方面？應(yīng)如何盡量減少