RTCA技術(shù)與乳酸脫氫酶釋放法對比

RTCA技術(shù)與乳酸脫氫酶釋放法對比RTCA技術(shù)簡介：

原理：實時無標記動態(tài)細胞分析技術(shù)（RTCA，RealTimeCellularAnalysis）是通過特殊工藝，將微電子細胞傳感器芯片整合到細胞檢測板的底部，用以構(gòu)建實時、動態(tài)、定量跟蹤細胞形態(tài)和增殖分化等改變的細胞阻抗檢測傳感系統(tǒng)。當(dāng)貼壁生長在微電極表面的細胞引起貼壁電極界面阻抗的改變時，這種改變與細胞的實時功能狀態(tài)改變呈相關(guān)性，通過實時動態(tài)的電極阻抗檢測可以獲得細胞生理功能相關(guān)的生物信息，包括細胞生長、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁等。RTCA技術(shù)檢測抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞殺傷作用（ADCC）實驗步驟：

1、向E-Plate檢測板中加入培養(yǎng)基并測定背景阻抗值。

2、收集對數(shù)期的靶細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞懸液濃度，向E-Plate檢測板中加入一定體積的細胞，室溫超凈臺內(nèi)放置30min。

3、將加入細胞的E-Plate檢測板放入檢測臺上（檢測臺預(yù)先放入培養(yǎng)箱中），進行實時動態(tài)的細胞增殖檢測。

4、過夜檢測后，向各培養(yǎng)孔中加入NK細胞及配制好的梯度抗體并繼續(xù)進行檢測，即可獲得實時的細胞效應(yīng)曲線。

應(yīng)用RTCA技術(shù)對抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞殺傷(ADCC)作用檢測示意圖：

特點：

1、實驗操作簡單，步驟少，人為誤差小。

2、采用無標記方法，對細胞無損傷，細胞在最接近生理狀態(tài)下進行檢測，結(jié)果準確度高。

3、實驗結(jié)果客觀，重復(fù)性好。

4、完整細胞效應(yīng)圖譜，提供大量、重要的動態(tài)反應(yīng)信息。

5、實驗數(shù)據(jù)的自動獲取。

6、可實現(xiàn)時間量效檢測。典型的利用RTCA技術(shù)獲得的抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞殺傷（ADCC）實驗檢測結(jié)果：

實時動態(tài)檢測IGF-1R抗體介導(dǎo)下NK-92細胞對DU-145細胞的殺傷作用（ADCC）實時監(jiān)測不同效靶比NK-92細胞對A549細胞的細胞毒性作用乳酸脫氫酶釋放法簡介：

原理：乳酸脫氫酶（LDH）存在于細胞內(nèi)，正常情況下，不能透過細胞膜。當(dāng)細胞受到損傷時，LDH可從細胞內(nèi)釋放至培養(yǎng)液中。釋放出來的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，使氧化型輔酶I（NAD+）變成還原型輔酶（NADH），后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）還原碘硝基氯化氮唑藍（INT）或硝基氯化四氮唑藍（NBT）形成有色的甲基化合物，在570nm波長處有一個吸收峰，利用讀取的光吸收值，可測得殺傷細胞毒活性。

乳酸脫氫酶釋放法基本實驗步驟：

1、收集對數(shù)生長期的靶細胞并計數(shù)，按一定濃度接種到細胞培養(yǎng)板中。細胞于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2、收集效應(yīng)細胞并計數(shù)，根據(jù)實驗設(shè)計，按照一定的效靶比加入效應(yīng)細胞并于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時。

3、2小時后，1000rpm離心5分鐘，取100ul上清液移入新孔內(nèi)，37℃孵育10分鐘。

4、每孔加入100ulLDH底物，室溫避光15分鐘。

5、加入1mol/L檸檬酸，30ul/孔。

6、酶標儀測定OD570nm的吸光度值。乳酸脫氫酶釋放法實驗結(jié)果：

RTCA技術(shù)與乳酸脫氫酶釋放法優(yōu)勢對比

RTCA技術(shù)乳酸脫氫酶釋放法

標記物

無，對細胞無傷害

有，對細胞有傷害

實驗數(shù)據(jù)

連續(xù)的實時動態(tài)曲線

終點檢測（單點數(shù)據(jù)）

實驗步驟

簡單

繁瑣

實驗重復(fù)性

高

低

實驗數(shù)據(jù)獲取

自動

手動

細胞活性信息

粘附、活力、形態(tài)

活力

時間量效檢測

一