黃芪湯中多糖的提取及含量測(cè)定研究

黃芪湯中多糖的提取及含量測(cè)定研究黃芪為豆科植物，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排毒斂瘡、利水消腫、加強(qiáng)免疫的功能，藥理實(shí)驗(yàn)表示清楚，黃芪多糖作為一種免疫抑制劑，具有保衛(wèi)急性心肌缺血，對(duì)抗心率失常，改善微循環(huán)的作用；白術(shù)多糖能調(diào)節(jié)免疫功能；甘草多糖為甘草主要的活性成分之一，具有抗補(bǔ)體和促有絲分裂等免疫調(diào)節(jié)作用以及抗腫瘤、抗病毒等作用[1]。因而，多糖是黃芪湯中的重要藥效成分之一。當(dāng)前，黃芪、白術(shù)、甘草單味藥中多糖的提取分離和含量測(cè)定的報(bào)道較多[2-4]，我們采取蒸餾水煮沸提取黃芪湯中的多糖，用苯酚-硫酸法對(duì)多糖進(jìn)行含量測(cè)定，為黃芪湯的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。1儀器與試藥VIS-723G可見分光光度計(jì)，LD-510離心機(jī)，101A-2型恒溫枯燥箱，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，F(xiàn)A1004N電子天平，SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵。防己、黃芪、甘草、白術(shù)藥材葡萄糖對(duì)照品〔含量測(cè)定用，純度大于99%〕購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所；無水乙醇、苯酚和濃硫酸等試劑均為分析純。2方法與結(jié)果2.1多糖的提取取工藝研究2.1.1多糖的提?。喝↑S芪湯全方14g〔黃芪5g、白術(shù)3g、甘草2g，下同〕，各加12倍量水煎煮3次，每次1.5h，用4層紗布過濾，合并濾液，濃縮為1：0.8〔1g生藥相當(dāng)于0.8mL藥液〕，參加95%乙醇，使含醇量為70%，低溫靜置12h以上，以4000r/min，離心10min，棄去上清液，取沉淀用水溶解，再離心一次，取上清液濃縮至1：08，參加95%乙醇，使含醇量為80%，低溫靜置12h以上，抽濾，沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌，抽干，在恒溫枯燥箱50℃枯燥，得多糖提取物[2]。2.1.2加水量的考察：稱取黃芪湯藥材14g共3份，第一份加8倍量水煎煮2次，每次25h，第二份加l2倍量水煎煮3次，每次1.5h，第三份加25倍量水煎煮2次，每次2h，分別用4層紗布過濾，合并濾液，其余按2.5項(xiàng)下的操作，加水量為藥材量12倍時(shí)，多糖提取率達(dá)9.7%.是較高的。2.1.3藥液相對(duì)濃度的考察：稱取黃芪湯藥材42g〔、.黃芪15g.白術(shù)9g、甘草6g〕，加12倍量的水煎煮3次，每次1.5h后，過濾濃縮，濾液平均分成三份，分別濃縮為1：0.8、1：1、1：1.2，分別參加95%乙醇，使含醇量為70%，其余按2.5項(xiàng)下的操作。結(jié)果多糖含量分別為12.2%、8.6%、4.3%，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)藥液相對(duì)濃度為1：0.8時(shí)，多糖提取率較高。2.2多糖的含量測(cè)定研究2.21供試品溶液的制備：精致細(xì)密稱取多糖提取物0.lg，置100mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成0.1mg/mL溶液，精致細(xì)密移取2.5mL稀釋液，置50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，振蕩搖勻，備用[5|。2.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精致細(xì)密稱取105℃枯燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100.6mg，置100mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻。再精致細(xì)密汲取溶液10mL，置于100mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.1006mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.2.3最大吸收波長(zhǎng)的選擇：精致細(xì)密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液各1.0mL，分別置10mL具塞試管中，加蒸餾水使成2.0mL，精致細(xì)密參加1.0mL苯酚溶液，搖勻，迅速參加5.0ml濃硫酸，靜置5min后，置沸水浴中反應(yīng)15min后取出并放至室溫，于400-600mm范圍內(nèi)掃描。測(cè)得兩者的最大吸收波長(zhǎng)均為為490mm。2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別汲取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，置25mL具塞試管中，加蒸餾水使成2.0mL，精致細(xì)密參加1.0mL苯酚溶液，搖勻，迅速參加5.0mL濃硫酸，靜置5min后，置沸水浴中反應(yīng)15min后取出并放至室溫，于490mm處測(cè)定吸光度〔A〕。以吸光度A對(duì)濃度C進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程A=60.047C-0.0006.r=0.9997。濃度C在0.0012一0.0013mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.2.5精致細(xì)密度試驗(yàn)：精致細(xì)密移取對(duì)照品溶液1.0mL，按2.2.4項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，吸光度的RSD為0.08%，表示清楚儀器精致細(xì)密度良好。2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)：精致細(xì)密移取供試液1.0mL按2.2.4項(xiàng)方法操作，測(cè)定吸光度。每隔30min測(cè)定一次，連續(xù)2.5h考察其穩(wěn)定性，吸光度的RSD為1.6%，結(jié)果表示清楚樣品溶液在2.5h內(nèi)顯色穩(wěn)定。2.2.7反復(fù)性試驗(yàn)：稱取黃芪湯劑的藥材共14g，按2.1.1項(xiàng)下方法操作，得多糖提取物1.8829g，精致細(xì)密稱取多糖提取物0.1g，共6份，按2.2.1項(xiàng)下操作配制供試品溶液，分別精致細(xì)密移取供試品溶液1.0mL，按2.2.4項(xiàng)下方法測(cè)定，并計(jì)算多糖提取物中多糖相對(duì)含量，平均為92.7%，再換算成黃芪湯劑中多糖的含量，平均為12.4%，RSD為2.6%，結(jié)果表示清楚該方法反復(fù)性良好。2.2.8加樣回收試驗(yàn)：精致細(xì)密稱取同一多糖提取物0.05g，共6份，分別精致細(xì)密參加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，其余按2.2.7項(xiàng)下操作，計(jì)算多糖回收率，結(jié)果見表。表1回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果2.2.9祥品含量測(cè)定稱取黃芪湯劑的藥材14g，共6份，按2.1.1項(xiàng)下方法操作，得多糖提取物，精致細(xì)密稱取多糖提取物0.1g，按2.2.1項(xiàng)下操作配制供試品溶液，分別精致細(xì)密移取供試品溶液1.0mL，按2.2.4項(xiàng)下方法測(cè)定，求得多糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2：表2黃芪湯的多糖含量測(cè)定結(jié)果3討論黃芪多糖屬于極性大分子化合物，重要由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn)，多糖的生物活性與分子量、溶解度、粘度、一級(jí)構(gòu)造和高級(jí)構(gòu)造有關(guān)，因而多糖提取時(shí)應(yīng)根據(jù)其有效成份的不同來設(shè)計(jì)工藝路線。試驗(yàn)中同時(shí)比較測(cè)定了黃芪、白術(shù)、甘草各單味藥材中多糖的含量，結(jié)果顯示黃芪湯中多糖的平均含量為13.1%，全方湯劑的多糖含量略高于黃芪、白術(shù)、甘草單藥湯劑的多糖含量之和。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5]用不同濃度的湯劑進(jìn)行醇沉?xí)r，濃度太高或太低都會(huì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)孝察顯示藥液相對(duì)濃度為1：0.8時(shí)，多糖提取率較高。采取水煮醇沉法報(bào)提取黃芪湯中的多糖是可行的，但步驟比較多，要求操作規(guī)范。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過應(yīng)留意：〔1〕取樣要均勻；〔2〕在醇沉?xí)r，加乙醇的速度和振搖頻率要控制得當(dāng)；〔3〕參加苯酚硫酸顯色劑時(shí)，應(yīng)懸空移液管，垂直快速參加。楊蓮芳、劉珍等[5]復(fù)方制劑中的多糖進(jìn)行試驗(yàn)，表示清楚樣品經(jīng)純化處理后用苯酚-硫酸法，更適用于多糖含量測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)由于時(shí)間有限，沒有對(duì)提取的多糖進(jìn)行純化，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果反復(fù)